MDC细胞培养技术.docVIP

孔板底面积9.6cm2,加培养液的量2.5ml,12孔板底面积4.5cm2,加培养液的量2ml,24孔板底面积2cm2,加培养液的量1ml,96孔板底面积0.32cm2,加培养液的量0.1ml,24孔板底面积2cm2,一般加培养液的量1ml,在接种病毒的时候一般病毒用量为添加培养液的5%-20%。在做咽拭子标本时应视标本的采集质量而定，如果标本采集质量高可以少加一些，如0.2ml-0.5ml,如果标本采集的不够好，则应相对加大标本接种量，可以加到1ml. 1： EDTA处理胰酶 　 GIBCO BRL Cat. # 15400 HEPES 缓冲液 1 M 母液 GIBCO BRL Cat. # 15630-080 D-MEM培养基 　 GIBCO BRL Cat. # 11965-092 青、链霉素母液 10,000 U/ml GIBCO BRL Cat. # 15140-122/100ml 牛血清白蛋白组分V 7.5%溶液 GIBCO BRL Cat. # 5260-037/100ml 三、MDCK细胞培养技术 （一）生物安全级别和生物安全规定 1. MDCK细胞培养实验室生物安全级别：正常MDCK细胞培养在生物安全二级实验室进行。 2. MDCK细胞培养实验室生物安全规定：遵守生物安全实验室相应的生物安全规定。 （二）MDCK细胞的传代培养步骤 1. 细胞培养所需的材料（部分试剂在此列出生产厂家货号仅供参考，可自行选择）： 生长成片的MDCK细胞； T-75细胞培养瓶,颈口有倾角； D-MEM培养液； 青、链霉素母液(10,000U/mL青霉素G；10,000μg/mL硫酸链霉素)，分装后保存于-20℃； HEPES缓冲液，1M母液； 胎牛血清； EDTA-胰酶(0.05％胰酶；0.53mMEDTA·4Na)（Gibco CatNo. 25300-062），分装后保存于-20℃； 牛血清白蛋白组分V，7.5％溶液（GIBCO CatNo. 15260）； 1mL和10mL无菌移液管等； 70％～75％的酒精。 建议：经常检查试剂使用的有效期和MDCK细胞的代数。 2. 培养基和试剂的准备: 500mL的D-MEM液中加入 青、链霉素母液5mL(终浓度达:100U/mL青霉素和100μg/mL链霉素)； HEPES缓冲液12.5mL(终浓度:25mM)； 7.5％牛血清白蛋白组分V12.5mL。 加入7.5%NaHCO310-15mL（终浓度：2-3%) 细胞生长液 10mL胎牛血清加到90mL的上述D-MEM液，使胎牛血清的终浓度为10％。每批胎牛血清均应进行血清测试，通过测试确定血清的最佳使用浓度。此处提到的血清使用浓度只是一个参考浓度。 3MDCK细胞的传代培养程序 此处以T-75细胞瓶单层培养为例，进行叙述。如果细胞瓶的规格有变，MDCK细胞悬液的浓度必须做相应的调整。用于细胞培养的培养基、EDTA－胰酶等，置37℃预热后，用70％～75％酒精擦拭后放于生物安全柜内。 弃去细胞已生长成片的细胞培养瓶中的培养液，加5mL37℃预热的EDTA-胰酶； 温和地摇动细胞瓶1min，使EDTA-胰酶均匀分布在整个细胞薄层。然后用移液管吸去EDTA-胰酶； 重新加入5mL37℃预热的EDTA-胰酶，重复上述步骤； 加1mLEDTA-胰酶使其均匀分布在整个细胞薄层，37℃孵育细胞瓶直至细胞从细胞瓶的塑料表面分离（约5min～10min）。必要时可以摇动或吹打来分离细胞。加入1mL胎牛血清中和残余胰酶的活性； 加9mL细胞生长液，轻轻移动移液管吹散细胞团，吹打从培养瓶底部一边开始到另一边结束，确保所有底部均被吹打到，吹打时动作要轻柔，尽量避免出现泡沫； 吹打后，瓶中加入90mL细胞生长液（细胞悬液的浓度约为每mL含105细胞），该培养液含终浓度为10％的胎牛血清； 每个T-25细胞培养瓶中加6mL(6×105/mL细胞)细胞悬液，剩余的细胞悬液可以加到另一T-75细胞瓶以用于细胞传代的种子。通常6mL细胞悬液2～3日可长成80%～90%的单层细胞片； 于37℃5%CO2培养箱里培养细胞，每天观察细胞状态。 注：细胞传代的比例可根据细胞生长状况和实验需要进行调节。消化液除EDTA-胰酶外，也可以用0.25％胰酶与Versene按照1:7的比例配成消化液使用。 （三）细胞的冻存 1细胞冻存材料 成片的MDCK细胞：80％～90％成片，细胞生长良好存活率高； 二甲基亚砜（DMSO）； 胎牛血清； EDTA-胰酶(0.05％胰酶；0.53mMEDTA·4Na)； 无菌移液管：1mL和10mL。 15mL无菌离心管 2细胞冻存步骤 冻存液的制备：胎牛血清9mL；二甲基亚砜1mL 细胞消化：消化过程同细胞培养的消化过程 细