单克隆抗体制备讲解.pptVIP

免疫原 1.抗原种类 微生物抗原、组织抗原和免疫球蛋白抗原。 2. 抗原纯度 一般的抗原只要达到亲合层析或SDS－PAGE电 泳纯即可。 3. 抗原用量 在一定范围内与免疫应答强度呈正相关。在应 用完全弗氏佐剂时，蛋白质类抗原剂量以0.5～ 1mg/kg体重为宜，加强免疫约为基础剂量的 1/2～1/3。 佐 剂 1. 概念 佐剂属非特异性免疫增强剂，与抗原一起注射或预先注入机体时，可增强机体免疫应答或改变免疫应答的类型。 2. 种类 1）卡介苗（BCG）、短小棒状杆菌（CP）、脂 多糖（LPS）、细胞因子； 2）氢氧化铝、明矾； 3）双链多聚肌苷酸：胞苷酸（poly I：C）和双 链多聚腺苷酸：鸟苷酸（poly A：U）； 4）矿物油、脂质体、免疫刺激复合物 （ISCOMs）、CPG寡核苷酸。 动 物 选 择 对免疫动物的主要要求有： 1. 应选择与抗原物质亲缘关系远的动物，特别是在制 备抗免疫球蛋白血清时更要注意。抗原物质的来源 生物与被免疫动物亲缘关系越远，免疫应答能力越 强，抗体产生水平越高，抗体亲和力也越强。 2. 动物生理状态正常，发育成熟，体重符合规定。家 兔初始免疫体重通常在2～2.5kg。 3. 性别上以雄性成年动物较常用，也可采用雌性非妊 娠动物。不能应用患病或刚刚病愈、有免疫缺陷或 应用免疫抑制剂的动物。 免疫方法 1. 免疫途径 1）注射方法：静脉、腹腔、肌肉、皮下、皮内和 淋巴结等。 2）免疫方法：小剂量、多点、多途径方法。 3）颗粒性抗原（细菌悬液、红细胞悬液）采用小 鼠腹腔注射。 4）可溶性抗原（如IgG）采用弗氏完全佐剂的乳 剂（油包水型），家兔背部多点皮下注射法。 1. 原理 根据致敏的单一B细胞克隆具有分泌特异性抗体和骨髓瘤细胞在体外长期增殖的特性，采用细胞融合技术在体外可将上述两种细胞融合形成杂交瘤细胞。杂交瘤细胞因具备了B细胞和骨髓瘤细胞的双重特性，即可分泌抗体，又能在HAT培养基中长期存活。因此，可通过HAT选择性培养，筛选出克隆化目的杂交瘤细胞株，再利用杂交瘤细胞培养上清或杂交瘤细胞接种小鼠产生的腹水，获取大量的来源于杂交瘤细胞分泌的单克隆抗体（monoclonal antibody, mAb）。 （5）细胞融合 1）将骨髓瘤细胞与脾脏细胞按1：10或1：5的比例混 合，在50ml离心管中用无血清培养液洗1次，离心 弃上清； 2）1min内加入37℃预温的1ml 50％PEG溶液，边加边 摇37℃水浴1min； 3）加37℃预温的不完全培养液以终止PEG作用，每隔 2min分别加入1ml、2ml、3ml、4ml、5ml和6ml； 4）离心，弃上清，用含20％小牛血清HAT选择培养液 重悬； 5）将上述细胞加入已有饲养细胞的96孔培养板内， 每孔100? l ，放入37℃ 5％CO2培养箱培养。 * * 实验研究的目的性 — 功能、形态、数量 实验设计的科学性 — 全面、动态、鲜明、对应、对照 实验方法的合理性 — 确切、先进 实验原理的内涵性 — 意义、要点 实验操作的规范性 — 准备、严格、准确、重复 免疫血清和单克隆抗体的制备 一、免疫血清的制备 1. 原理： 机体具有多种B细胞克隆，将适当的抗原物质注入人或动物体内后可被不同的B细胞克隆同时识别，经过一定时间，受刺激的B细胞克隆针对抗原表位的多少而产生相应的特异性抗体，每一抗原表位都能诱发相应B细胞克隆产生单克隆抗体，此获得的血清即为含多种单克隆抗体的混合物，称之为多克隆抗体免疫血清，简称免疫血清。 优质免疫血清的产生，主要取决于抗原的纯度和免疫原性，以及动物的免疫应答能力。此外，尚需考虑免疫途径、抗原剂量、注射次数、时间间隔和有无佐剂等因素。 4. 抗原的处理 1）颗粒性抗原：红细胞、菌体等制成悬液，不需佐 剂，直接免疫。菌体数1×1010个/ml 为宜。 2）可溶性蛋白质抗原（如人IgG）、病毒抗原、细菌 可溶性抗原组分