分子生物学验讲义.docVIP

分子生物学实验讲义 Experimental Direction of Molecular Biology 昆明医学院基础学院 生物化学教研室 Department of Biochemistry Faculty of Basic Medical Sciences, Kunming 2007年3月 实验一 质粒DNA的提取与限制酶切鉴定 Isolation of Plasmid DNA and Identification by Restriction Digestion 一、??目的(Objectives) 掌握质粒DNA小量快速提取法；了解DNA限制性核酸内切酶酶切鉴定原理。 二、?原理(Principles)) 质粒（plasmid）是一种染色体外的稳定遗传因子。其分子量大小在1－200kb之间。是具有双链闭合环状结构的DNA分子，质粒主要发现于细菌、放线菌和真菌细胞中，具有自主复制和转录能力，能使子代细胞保持它们恒定的拷贝数，可表达它携带的遗传信息。质粒一般独立游离在细胞质内，也可整合到细菌染色体中，它离开宿主的细胞就不能存活，而它控制的许多生物学功能却赋予宿主细胞某些表型。 所有分离质粒DNA的方法都包括3个基本步骤：培养细菌使质粒扩增；收集和裂解细菌；分离和纯化质粒DNA。采用溶菌酶可破坏菌体细胞壁，十二烷基硫酸钠（Sodium dodecyl sulfate, SDS）可使细胞壁裂解。细菌经溶菌酶和阴离子去污剂（SDS）处理后，细菌DNA缠绕附着在细胞壁碎片上，离心时易被沉淀出来，而质粒DNA则留在上清液中。再经酒精沉淀、洗涤处理，可得到质粒DNA。 共价闭环DNA（covalently closed circular DNA，简称cccDNA）质粒以超螺旋形式存在。若两条链中有一条链发生一处或多处断裂，分子就能旋转而消除链的张力，这种松弛型的DNA分子叫作开环DNA（open circular DNA, 简称ocDNA）。在电泳时，同一质粒如以cccDNA形式存在，它比其开环和线状DNA的泳动速度都快，因此在本实验中，质粒DNA在电泳凝胶中呈现3条区带。 限制性内切酶是分子生物学研究中的一种工具酶，这类酶的特点是具有能够识别双链DNA分子上的特异核苷酸顺序的能力，能在这个特异性核苷酸序列内，切断DNA的双链，形成一定长度的DNA片段。如：EcoRⅠ和HindⅢ的识别序列和切口是： ? EcoRⅠ：G↓AATTC ? HindⅢ：A↓AGCTT 限制性内切酶对环状质粒DNA有多少切口，就能产生多少酶切片段，因此鉴定酶切后的片段在电泳凝胶的区带数，就可以推断酶切口的数目，从片段的迁移率可以大致判断酶切片段大小的差别。用已知分子量的线状DNA为对照，通过电泳迁移率的比较，就可以粗略推测分子形状相同的未知DNA的分子量。 三、?主要设备、实验材料和试剂（Equipments, Materials and Agents） 1．主要设备(Equipments) （1）塑料离心管1.5mL×30 （2）塑料离心管架×1 （3）微量加样器10μL、100μL、1 000μL各一支 （4）常用玻璃仪器及滴管等 （5）台式高速离心机（16 000r/min） （6）电泳仪 （7）电泳槽 （8）样品槽模板 2．材料(Materials)：质粒转化大肠杆菌 3．试剂(Agents) （1）溶液Ⅰ：pH8.0 G.E.T 缓冲液（50mmol/L葡萄糖，10 mmol/L EDTA，25mmol/L Tris-HCl）；用前加溶菌酶4mg/mL。 （2）溶液Ⅱ:1mol/L NaOH 40μl , 5%SDS 40μl ,蒸馏水120μl，临用时配制。 （3）溶液Ⅲ：pH 4.8乙酸钾溶液（60mL 5mol/L KAc，11.5mL冰乙酸，28.5mL H2O） （4）苯酚/氯仿（1∶1，V/V）：苯酚需在160℃重蒸，加入抗氧化剂8-羟基喹啉，使其浓度为0.1%，并用Tris-HCl缓冲液平衡两次。氯仿中加入异戊醇，氯仿/异戊醇（24∶1，V/V）。 ?（5）pH 8.0 TE缓冲液：10mmol/L Tris，1mmol/L EDTA，其中含有RNA酶（RNase）20μg/mL。 （6）TAE电泳缓冲液： （7）DNA 染色试剂Sybr Green 或EB染色液： （8）10X上样缓冲液 （9）DNA分子量标准物（DNA Marker） 四、操作步骤(Methods) 1．培养细菌(cultivation of bacteria) 将带有质粒的大肠杆菌于培养液中过夜培养 2．细菌中质粒DNA的快速提起（Rapid Isolation of Plasmid DNA From Bacteria） （1）取液体培养菌液1.5 mL