01-212级硕士高级免疫学实验技术-概述.ppt

免疫学实验技术概述 现代免疫学技术 免疫学技术的范畴 1、对具有免疫活性物质的定性、定量测定 2、对免疫系统的组成成分的数量、状态的测定 免疫学检测技术的评价 一、评价标准 Specificity（特异） Sensitivity（敏感） Simplicity（简便） Safety（安全） Saving（节约） 二、特异性与敏感性的关系 特异性高、敏感性低 敏感性高、特异性低 免疫学实验技术概述 抗原抗体反应 淋巴细胞的检测技术 细胞因子的检测技术 免疫学常用的分子生物学技术 多克隆抗体 单克隆抗体 基因工程抗体 前两者常用于实验研究，而后者用于临床治疗研究。 抗体的应用 多克隆抗体是通过免疫动物血清分离获得 优点：制备方法比较简单，价格低廉，制备所需时间短等 在确定新基因编码蛋白研究方面，仍然是首选抗体类型。但由于多克隆抗体含有针对多个抗原表位的抗体成分，也可能包括抗原变性后暴露的新抗原表位，因此，多克隆抗体在检测变性抗原——如采用Western Blot检测蛋白时，其效果比单克隆抗体更敏感。 多克隆抗体 缺点： 纯度差 易发生交叉反应 来源有限 所产生的抗体因动物个体差异滴度不同 不易标准化 因免疫动物血清中含有非常复杂的多种蛋白质成分，所以在进行实验室分析、检测之前，必须将其有效的抗体成分分离、纯化。 多克隆抗体 单克隆抗体(mAb)是通过B细胞杂交瘤获得 与多克隆抗体相比，单克隆抗体主要具有以下三个显著特点（优点）： ①高度均质性 ②高度特异性 ③来源稳定 不足： 制备方法比较复杂，价格昂贵，制备所需时间较长。 单克隆抗体 mAb是由起始于一个B淋巴细胞的单克隆细胞系所分泌的，因此是一种每个抗体分子的结构(包括氨基酸排列顺序和空间构型)都相同的均质性抗体。 高度均质性 mAb只专一的识别抗原分子上单个抗原位点，因此容易获得特异性抗体，较少产生交叉反应。 高度特异性 可大量生产，当得到稳定分泌mAb的杂交瘤细胞系后，可置液氮中长期保存，需要时取出复苏，既可在体外培养中收获mAb，也可将杂交瘤细胞接种入同系小鼠腹腔内，然后从荷瘤小鼠的腹水中收获大量mAb。 来源稳定 根据实验的目的不同，其分离、纯化的纯度要求也不同。 作为ELISA检测时的抗体，部分情况下饱和硫酸胺纯化即可； 最常使用的抗体是经过A蛋白(Protein A)亲和层析获得的IgG型抗体； 免疫放射测定的标记用抗体必须达到双级纯才可应用(亲和层析纯+SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳纯)。 纯度要求 单克隆抗体在制备过程中经过严格的筛选，因此应根据不同的应用目的选择不同单克隆抗体亚类，如标明供ELISA检测用的单克隆抗体，可能不适合Western Blot检测。 作为初学者尤其应该注意各类单克隆抗体标明的应用范围，而多克隆抗体一般情况下均有较宽的适用范围。 适用范围 一抗和二抗 一级抗体：抗原特异性的抗体 二级抗体：抗抗体（针对一抗的Fc段，具有种属特异性） Ag Ag 沉淀反应 凝集反应 免疫标记技术 抗原抗体反应 淋巴细胞的检测技术 淋巴细胞的分离 淋巴细胞的功能测定技术 细胞因子的检测技术 生物活性检测 免疫学检测 分子杂交 PCR检测 免疫学常用的分子生物学技术 免疫印迹技术 免疫PCR 免疫沉淀 * * LOGO LOGO LOGO LOGO LOGO LOGO LOGO LOGO LOGO LOGO LOGO 高级免疫学实验技术 2012级硕士研究生 吉林大学白求恩医学院 免疫学系 袁红艳 选用教材 免疫学实验课要求 不许迟到、早退、缺课。 不允许擅自换教室。 穿白大衣。 爱护实验器材（使用后用水冲洗，然后放入指定地点），损坏者按价赔偿。 课后认真打扫教室卫生（擦地面和桌面）。 关掉手机或设置为振动状态。 实验分组 实验操作内容安排 淋巴细胞转化试验 酶联免疫吸附试验（ELISA） 免疫印迹试验(Western blot) 巨噬细胞吞噬功能测定 免疫细胞的分离 淋巴细胞功能检测 经典的抗原抗体反应 免疫标记技术 多克隆抗体的制备 免疫分子生物学技术 细胞因子的检测 单克隆抗体的制备 自讲安排 自讲评分标准 评估细则 分值 积极参与，注重个性发挥 2 备课充分,具有简单讲稿或提纲 4 讲授内容准确、熟练、清楚 4 板书(或幻灯)工整、清晰 2 注重联系相关知识 2 熟练运用专业词汇 2 形式多样，启发诱导 2 教态大方，语言文雅、生动 2 总计 20 考核方式 考核要求 自讲自评（20分），每组成员合作准备资料和上讲台讲述，老师及其他组给评分，取平均成绩，4人给相同的自讲成绩。 综合考试（40分），共四个大题，每题10分。（周五下午） 出勤情况（10分），每4学时1分。 实验设计（30分）