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蛋白表达研究系列之——Western Blot试验操作指南 目 录 目录 1 一、总蛋白的提取 2 1 试验类型和蛋白类型 2 2 样品组织类型 3 3 蛋白表达峰度判断 4 4 总蛋白提取的基本步骤 4 4.1细胞样品总蛋白的提取操作步骤 5 4.2组织样品总蛋白的提取操作步骤 5 二、总蛋白BCA定量 6 三、SDS凝胶电泳 7 四、转膜 8 五、信号增强剂处理膜 9 六、封闭、一抗孵育、二抗孵育 9 1 封闭 9 2 一抗孵育 9 3 二抗孵育 13 七、曝光显色 14 八、灰度分析 15 九、抗体及相关溶液配制 15 1 抗体 17 2 相关溶液配制表 17 蛋白检测相对于DNA/RNA的检测来讲要困难许多，Western Blot作为蛋白检测的经典方法短时间内仍然无法被取代。Western Blot的原理并不复杂，网上有很多这方面的材料，这里不作过多的介绍。虽然原理、操作并不复杂，但做好Western Blot、得到满意的图片并非易事。其操作过程中涉及到：蛋白提取、电泳、转膜、杂交、显色、抗体的选择、试剂的选择、设备应用等诸多内容，其中每一个环节的差错对最后的试验结果都会产生不小的影响，最终导致试验失败。很多同学都在抱怨自己的Western Blot没有信号、目的条带太弱、杂带太多、条带弯曲、泳道中有涂抹状背景等诸多问题，大部分情况都会最终把矛头指向抗体，认为这个抗体质量不好。抗体质量肯定会对试验产生相当重要的影响，但绝不是全部。你的操作方法可能是对的，但，是否合理、是否适合你的试验要求，你可能未必了解。我们课题组Western Blot的任务量极重（每年ECL的用量都在5L以上），课题组里面的一些同学总是在不停的问我关于条件优化的问题，我不可能为每一个人找到问题的关键点，因此，写一份关于Western Blot的系统性材料非常有必要，希望你们可以针对自己的问题，自我分析、自我解决，这样也能锻炼你们独立解决问题的能力。 一、总蛋白的提取 总蛋白作为Western Blot试验的原始材料，可以说是试验的根基。蛋白提取不好、提取效率差、试剂选取不合理，后面的试验就基本不用做了，肯定会发生没有信号、信号弱、背景高、泳道中有涂抹状背景等问题。做试验之前这些信息需要考虑和查询：（1）试验类型；（2）目的蛋白类型；（3）样品组织类型；（4）蛋白表达峰度判断。 1 试验类型和蛋白类型 （1）如果是IP试验，样品的蛋白提取务必使用碧云天的Western及IP细胞裂解液（货号：P0013）。HaiGene的超强RIPA裂解液虽然能有效的裂解样品，但其成分对后续分离蛋白复合物有影响。如果是细胞核内的蛋白研究，样品裂解30min后，放置到超生破碎仪上30～50W，工作4s，间隙6s，超声5次。这样能有效的将细胞核裂解，并打碎基因组DNA和RNA，有两个目的：第一，碧云天的Western及IP细胞裂解液对细胞核有一定的裂解能力，但并不能完全裂解细胞核，通过超声可将细胞核完全裂解，从而释放更多的核蛋白，这样后续检测能获得更高的灵敏度；第二，细胞核中的蛋白总是与基因组DNA结合在一起，如果不将DNA打碎，核蛋白仍然跟基因组DNA结合在一起，样品离心过程中，容易发生基因组DNA-蛋白复合物大分子沉淀，从而丢失这部分核蛋白，通过超声将DNA打碎后，彻底释放核蛋白，从而获得更多的目的蛋白。 （2）如果是单纯的Western Blot试验，使用HaiGene的超强RIPA裂解液（货号：C2501）和Benzonase核酸酶（货号：C2001）。这个RIPA裂解液裂解能力更强，可获得更多的总蛋白，它可以完全裂解细胞核、线粒体，并可提取到更多的膜蛋白。如果后续杂交的蛋白有细胞核、线粒体和膜蛋白，则务必使用这个RIPA裂解液，它能提取到很多Western及IP细胞裂解液提取不到的蛋白。但使用HaiGene的超强RIPA裂解液必须要使用Benzonase核酸酶，这个酶能迅速降解基因组DNA和RNA，从而使样品不粘稠（粘稠的样品，在胶孔上样时将很困难），还能提高总蛋白提取效率（尤其是核蛋白）。 总结：根据试验类型和目的蛋白的表达定位情况，选取合适的裂解液，确定是否需要超声处理即可。 2 样品组织类型 我们组的样品就两种：细胞和动物组织。 （1）先说一下细胞样品的处理，细胞样品由于很纯、都是单个细胞，容易裂解，处理非常容易。可能遗漏点在凋亡（或死亡）的那部分悬浮细胞。Western Blot试验要求细胞至少6孔板一孔（融合度85％），最好2～3孔，这样细胞量比较足。当然也要看蛋白的表达峰度情况，蛋白表达峰度低的可用一个25cm2培养瓶的细胞。细胞于胰酶消化、终止后，8000rmp离心5～10min（1.5ml EP管），留底部细胞团块，加入1m