Westrn_Blot_技术.pptVIP

* 去除PPT模板上的--无忧PPT整理发布的文字 首先打开PPT模板，选择视图，然后选择幻灯片母版 然后再在幻灯片母版视图中点击“无忧PPT整理发布”的文字文本框，删除，保存即可 更多PPT模板资源，请访问无忧PPT网站-- 使用时删除本备注即可 ? 将此幻灯片插入到演示文稿中 将此模板作为演示文稿（.ppt 文件）保存到计算机上。 打开将包含该图像幻灯片的演示文稿。 在“幻灯片”选项卡上，将插入点置于将位于该图像幻灯片之前的幻灯片之后。（确保不要选择幻灯片。插入点应位于幻灯片之间。） 在“插入”菜单上，单击“幻灯片（从文件）”。 在“幻灯片搜索器”对话框中，单击“搜索演示文稿”选项卡。 单击“浏览”，找到并选择包含该图像幻灯片的演示文稿，然后单击“打开”。 在“幻灯片（从文件）”对话框中，选择该图像幻灯片。 选中“保留源格式”复选框。如果不选中此复选框，复制的幻灯片将继承在演示文稿中位于它之前的幻灯片的设计。 单击“插入”。 单击“关闭”。 Western Blot 技术 概述 Western blot的中文名称是：蛋白质印迹。是分子生物学、生物化学和免疫遗传学中常用的三种印迹技术之一（其他两种是Southern blot——DNA印迹和Northern blot——RNA印迹，且均为验证试验中的金指标）。 目前公认的该实验技术的发明人为美国斯坦福大学的乔治·斯塔克（George Stark）。在尼尔·伯奈特（Neal Burnette）于1981年所著的《分析生物化学》（Analytical Biochemistry）中首次被称为Western Blot。 原理 Western Blot与Southern印记杂交或Northern杂交方法类似，但Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。经过PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维膜-NC膜，PVDF膜等）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。 分类 Western Blot显色的方法主要有以下几种： 　　i. 放射自显影 　　ii. 底物化学发光ECL 　iii. 底物荧光ECF 　　iv. 底物DAB呈色 　　现常用的有底物化学发光ECL和底物DAB呈色，体同水平和实验条件的是用第一种方法，目前发表文章通常是用底物化学发光ECL。原理如下（二抗用HRP标记）：反应底物为过氧化物+鲁米诺，如遇到HRP，即发光，可使胶片曝光，就可洗出条带。 基本方法 蛋白质的制备 蛋白的提取： 倒掉培养液，并将瓶倒扣在吸水纸上使吸水纸吸干培养液 每瓶细胞加3ml 4℃预冷的PBS（0.01M pH7.2～7.3）。平放轻轻 摇动1min洗涤细胞，然后弃去洗液。重复以上操作两次，共洗细胞三次以洗去培养液。将PBS弃净后把培养瓶置于冰上。 按1ml裂解液加10 ?l PMSF（100mM），摇匀置于冰上。（PMSF要摇匀至无结晶时才可与裂解液混合。） 每瓶细胞加400 ?l含PMSF的裂解液，于冰上裂解20min，为使细胞充分裂解培养瓶要经常来回摇动。 裂解完后，用干净的刮棒将细胞刮于培养瓶的一侧（动作要快），然后用枪将细胞碎片和裂解液移至1.5ml离心管中。（整个操作尽量在冰上进行。） 于4℃下12000rpm离心5min。（提前开离心机预冷） 将离心后的上清分装转移倒0.5min的离心管中放于－20℃保存。 蛋白质的测量： 使用标准试剂盒，按照说明书操作 蛋白质样本的固定： 使用标准试剂盒，按照说明书操作。（固定时蛋白质总浓度应当保证至上样时达到50?g/孔） SDS电泳 配胶： 玻璃板对齐后放入夹中卡紧。然后垂直卡在架子上准备灌胶。（操作时要使两玻璃对齐，以免漏胶。） 配10％分离胶，加入TEMED后立即摇匀即可灌胶。灌胶时，可用10ml枪吸取5ml胶沿玻璃放出，待胶面升到绿带中间线高度时即可。然后胶上加一层水，液封后的胶凝的更快。（灌胶时开始可快一些，胶面快到所需高度时要放慢速度。操作时胶一定要沿玻璃板流下，这样胶中才不会有气泡。加水液封时要很慢，否则胶会被冲变型。） 当水和胶之间有一条折射线时，说明胶已凝了。再等3min使胶充分凝固就可倒去胶上层水并用吸水纸将水吸干。 配4％的浓缩胶,加入TEMED后立即摇匀即可灌胶。将剩余空间灌满浓缩