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Western Blotting实验手册 1. Western blotting 实验简介 Western Blotting或称为Immunoblotting，中文名称为免疫印迹。其程序是对经处理的样本（血清、培养细胞和组织匀浆）先进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS)，以分离蛋白质。然后将电泳后的分离开的蛋白质转移至具有结合力的膜上。对转印膜进行封闭，以防止免疫试剂的非特异性吸附。酶促反应比同位素安全且快速可以搭配不同的底物从而实现不同的显色方法：化学发光和底物显色化学发光法化学发光法的灵敏度已经达到pg级别灵敏度超过了同位素底物显色于直接显色而操作简便且成本低；而底物显色由于直接显色而操作简便且成本低HRP 辣根过氧化酶灵敏度高发光持久可反复曝光HRP 辣根过氧化酶HRP 辣根过氧化酶比活高、特异性更强、分子量小（40kD）、稳定和作用底物范围广的优点而得到广泛使用。HRP的底物种类有不少，主要可以分为化学发光底物和底物2大类。化学发光底物灵敏度高（灵敏度已经达到pg级别，甚至还有 Femto级别的），发光持久（6-24小时），可反复曝光，稳定性好（室温贮藏6个月，4至少是12个月），节约抗体（由于灵敏度高，一抗二抗稀释倍数，这对于宝贵一抗来说十分重要）底物DAB，AEC，bcip/nbt法显色其中DAB法最常见，DAB可以和HRP作用形成褐色不溶性产物，灵敏度高，特异性好，缺点就是需要现配现用，显色后光照数小时会褪色，不能永久保存，需要拍照记录。 蛋白分子量 (KD) 分离胶浓度(%) 100 8% 30～100 10% 10～30 12% 10 15% 1 按比例配置分离胶，轻缓摇动8-10下，不要过于剧烈以免引入过多氧气。待凝胶溶液混合均匀，将凝胶溶液平缓注入两层玻璃板中，再在液面上小心注入一层水，以阻止氧气进入凝胶溶液中影响凝胶的聚合，保持水平，在37度恒温箱中静置1h。 2 同前按比例配置浓缩胶，摇动时不要过于剧烈，吸去不连续系统中下层分离胶上的水分，以连续平稳的液流注入浓缩胶溶液，然后小心插入梳子，并注意齿尖不要有气泡。在37度恒温箱中静置1h时，以保证完全聚合，小心拔出梳子，准备点样。 点样 向电泳槽中加入电泳液，使两块玻璃内侧电泳液高于点样孔，外侧电泳槽内电泳液浸没凝胶底部。玻璃板内侧液面高于外侧。然后开始点样，注意加样时间尽量短。 电泳 加样完毕，盖好电泳槽的盖子，注意正负极，并选择适当的电压进行电泳。通常在不连续的系统中，上层浓缩胶的电泳电压要低于分离胶电泳电压，以达到更好的浓缩效果，使样品进入分离胶时处于同一水平线上。电泳直至溴酚蓝染料前沿下至凝胶末端处停止电泳，电泳时间2-3h。 染胶 电泳完毕可通过考马斯亮蓝染色检测电泳是否成功 将凝胶取出放入盒中，倒入少量染色液，以浸没凝胶为宜，在摇床上震荡，直到胶上出现明显条带为止，一般5h或过夜，然后倒去染色液，用脱色液洗涤，期间换1-2次脱色液，直至颜色清亮，背景清楚为止。 转印 湿式电转印 电泳结束后取出凝胶，在Tris/甘氨酸转印缓冲液中漂洗数秒。取凝胶方法：用刀片将两块玻璃板分开，将上层浓缩胶划去。 打开电转印夹，每侧垫上一块专用的用转印液浸泡透的海绵垫，再各放一块转印液浸透的三层滤纸，将凝胶平放在阴极侧滤纸上，最后将NC膜平放在凝胶上，去除气泡，夹好电转印夹，注意NC膜与胶，NC膜与滤纸，滤纸与胶之间不能有气泡。 转印槽加满电转印缓冲液，插入电转印夹，将电泳槽放入冰箱内（-20度），连接好电极，接通电流，转印夹的NC膜应对电泳槽的正极 4. 转印选择恒流，每个转印槽建议电流为150mA, 转印完毕可用丽春红S染膜，检测转印是否成功 转印结束后，将NC膜置于丽春红S溶液中，室温5-10min即可看见红色条带，用TBS洗数次即可洗掉红色条带进行后续实验 封闭 洗转印膜：室温漂洗3次*10min，以尽量洗去膜上的SDS，以防止影响后面抗体的结合。 取漂洗过的转印膜，放入5%脱脂奶粉的封闭液内，摇床摇动，4度封闭1.5h。 常用的封闭液有0.2%的TWEEN-20,3%BSA,10%马血清，5%的脱脂奶粉 抗体的杂交 主要采用间接法，即先加入未标记的特异性抗体（Ab1）与膜上的抗原结合，再加入HRP（或生物素）标记的抗抗体（Ab2）进行杂交检测。 向封闭后的杂交膜加入抗体稀释液稀释后的一抗，盖上保鲜膜，四度孵育过夜。 TBS-T洗膜3-6次*10min 加入抗体稀释液稀释的标记的二抗，4度孵育2h，洗膜3-6次，每次10mins。 检测 根据标记二抗的标记物的不同，其杂交的结果检测方法也不同，常用的检测系统有HRP标记的Ab2的增强发光（ECL）Western blot实验注意事项 一 组织样品