实验二 RNA提取解析.docVIP

实 验 二 小量法提取植物总RNA 1 实验目的： 通过本实验的学习，了解植物RNA的提取方法，原理；掌握分子生物学实验的基本方法。2 材料 长春花叶片 3 试剂： 裂解液RL,去蛋白液RW1,漂洗液RW，RNase-free ddH2O,DnaseI，缓冲液RDD 4 仪器设备 离心机、离心管、紫外分光光度计、微量移液器、枪头、冰箱、电子天平、高压灭菌锅、一次性手套、电泳仪等。 4.1 实验用的枪头，离心管，PCR管子，以及用于临时盛放Buffer的瓶子均用0.1% DEPC水泡过夜，然后灭菌两次，80℃烘干。 4.2 实验用的镊子，药匙，研钵，高压灭菌（121℃，20min）两次。5 方法与步骤： 漩涡震荡仪混匀，静置5min。 2.加入0.2ml 氯仿，来回颠倒15s，静置2~3min。12000rpm，4℃，离心15min，吸取上清液（约500μl）于新的RNAfree离心管。 3.缓慢加入0.5倍上清体积的无水10μl体系 mix 2μl RNA 500ng Add to 10μl 6 实验结果： 7 实验分析：RNA 提取是进行Northern blotting、体外翻译和建立cDNA 文库等分子生物学研究的前提 。早期高质量RNA 的提取有很大难度，因为提取过程较繁复，RNA 极易被RNA酶水解，以及RNA 酶来源广泛又非常稳定。庆幸的是，自Chomczyski 和Sacchi(1987) 提出异硫氰酸胍一步法提取RNA 以来，该状况有了很大的改善。一步法的核心是采用RNA 酶的抑制剂－异硫氰酸胍和巯基乙醇抑制RNA 酶的活性。在pH5.3 酸性环境中，DNA 和RNA 分别主要分配在有机相和水相中，蛋白则经有机溶剂变性而除去。因此，含RNA，DNA 和蛋白的水溶液经有机溶剂变性和分相一步处理，DNA 主要游离进入有机相，而蛋白则变性。水相剩下有RNA、RNA 酶的抑制剂、未变性的蛋白和少量DNA。水相再经重复的变性和分相处理，就只剩下RNA 和RNA 酶的抑制剂，经醇沉淀可获得高质量的RNA。一步法提取简单，RNA 始终被RNA 酶的抑制剂所保护，对许多材料效果显著。 Trizol 法也基于相类似的原理。但遗憾的是，一步法不能提取富含（水溶性）多糖和多酚等物质中的高质量RNA。因为这些物质的许多理化性质与RNA 相似，如多糖也主要分配在水相，也可被醇沉淀。更糟糕的是，含多糖和RNA 的水相一经醇沉淀，多糖易与RNA 共沉淀，此时RNA 便不能再溶解。 目前的对策有：第一，用SDS- 盐酸胍、高浓度Na+ 或K+ 离子改变多糖的溶解特性，使其主要分配在有机相中，此时通过苯酚和氯仿抽提可去掉部分的多糖。 第二，选择性沉淀多糖或RNA，如LiCl 沉淀RNA，多糖则留在上清液中；低浓度乙醇（10％ ~30％）沉淀多糖，而RNA则要在75%乙醇中才能沉淀下来；醋酸钾溶液沉淀多糖；低浓度乙醇和醋酸钾溶液共同沉淀多糖；在高浓度的NaCl下，经低浓度乙醇或2-丁氧乙醇来沉淀多糖。但即使如此，仍有相当多的多糖与RNA 混杂在一起。第三，在沉淀RNA 之前，再采用乙二醇丁醚分相把多糖去掉。多酚和色素等次生代谢物质极易被氧化成红褐色物质，然后与核酸不可逆的结合。目前对策有：（1）加入巯基乙醇或二硫苏糖醇（DTT）等，防止酚类物质被氧化，NaBH4 等；（2）加螯合剂聚乙烯吡咯烷酮（PVP）和聚乙烯聚吡咯烷酮（PVPP），其CO－N＝ 基有很强的结合多酚化合物的能力，两者形成稳定的复合物，使之不能成为多酚氧化酶的底物而被氧化；（3）加Tris- 硼酸（pH7.5），硼酸可以与酚类化合物依靠氢键形成复合物，从而抑制了酚类物质的氧化及其与RNA 的结合；（4）-70℃ 的丙酮抽提冷冻研磨后的植物材料，可以有效地从云杉、松树、山毛榉等富含酚类化合物的植物材料中分离到高质量的RNA；（5）低pH 值（pH5.5）的提取缓冲液可以防止酚类化合物的氧化。必须指出的是，尽管已从许多材料包括富含多糖的材料中提取了高质量的总RNA，但用同一方法所得结果相差很大，如有人报告CTAB 法对提取富含多糖的总RNA 提取很有效。 很好的一篇关于RNA抽提的综述文章。对大部分实验人员来说，RNA 抽提比基因组DNA 抽提要困难得多。事实上，现有的RNA 抽提方法/试剂，如果用于从培养细胞中抽提 RNA，比抽提基因组 DNA 更方便，成功率也更高。那为什么同样的方法用于组织RNA 的抽提，总会碰到问题呢？ 组织RNA 抽提失败的两大现象是： RNA 降解和组织内杂质的残留。关于降解问题，首先看一下为什么从培养细胞中抽提RNA 不容易降解。现有的RNA 抽提试剂，都含有快速抑制 Rnase 的成分。在培养细胞中加