血清Alb、γ-G测定实验报告[精选].docVIP

生物化学实验报告 姓 名： 学 号： 专业年级： 组 别： 生物化学与分子生物学实验教学中心 实验名称 γ-球蛋白分离、纯化与纯度鉴定 实验日期 2014-11-20 实验地点 第4实验室 合作者 指导老师 评分 教师签名 批改日期 实验目的 掌握凝胶层析法分离蛋白质的原理和基本方法 掌握离子交换层析法分离蛋白质的原理和基本方法 掌握醋酸纤维素薄膜电泳法的原理和基本方法 了解柱层析技术 二、实验原理 清蛋白A 球蛋白 (1 (2 ( ( 等电点 相对分子量（×104） 含量（％ 4.88 6.9 57~67 5.06 20 2~5 5.06 30 4~9 5.12 9~15 6.2~12 6.85~7.3 15.6~30 12~20 粗提（盐析法） 盐析法是在蛋白质溶液中,加入无机盐至一定浓度,或达饱和状态,可使蛋白质在水中溶解度降低,从而分离出来。 蛋白质溶液中加入中性盐后，由于中性盐与水分子的亲和力大于蛋白质，致使蛋白质分子周围的水化膜减弱乃至消失。同时，中性盐加入蛋白质溶液后由于离子强度发生改变，蛋白质表面的电荷大量被中和，更加导致蛋白质溶解度降低，蛋白质分子之间聚集而沉淀。 由于血清中各种蛋白质分子的颗粒大小、所带电荷的多少和亲水程度不同，故盐析所需的盐浓度也不一样。所以调节盐的浓度可使不同的蛋白质沉淀从而达到分离的目的。 脱盐 盐析分离的蛋白质溶液中含有大量无机盐，必须先脱盐后才能进一步纯化。脱盐有多种方法，本实验采用凝胶层析法。凝胶层析法主要是根据混合物中各种物质分子大小的不同而将其分离的技术。 纯化（离子交换层析） 离子交换层析是指流动相中的离子和固定相上的离子进行可逆的交换，利用化合物的电荷性质及电荷量不同进行分离 纯度鉴定 血清中各种蛋白质的等电点不同，一般都低于pH7.4。它们在pH8.6的缓冲液中均解离带负电荷，在电场中向正极移动。由于血清中各种蛋白质分子大小、形状及所带的电荷量不同，因而在醋酸纤维素薄膜上电泳的速度也不同。因此可以将它们分离为清蛋白（Albumin)、α1-球蛋白、α2-球蛋白、β-球蛋白、γ-球蛋白5条区带。 三、材料与方法1.器材 葡聚糖凝胶层析柱（内经1.0cm，高7cm，砂芯滤板）1支 DEAE纤维素阴离子交换层析柱（内经1.0cm，高6cm，砂芯滤板）1支 烧杯1个 吸管（1ml、10ml10个 试管6个 离心管2个 黑色反应板1个 固定铁架1个 螺旋夹2个 离心机1台 2.药品 大牛血清 0.3mol/LpH6.5醋酸铵缓冲溶液 0.06mol/LpH6.5醋酸铵缓冲溶液 0.02mol/LpH6.5醋酸铵缓冲溶液 0.92mol/L（20%） 0.05mol/L（1%）BaCl21.5mol/L NaCl—0.3mol/L NH4AC溶液 0.9%氯化钠溶液 pH8.61.离心要注意三点： （1）（2）（3）2.分离上清液与沉淀时： （1）（2）3.加球蛋白溶液前，在胶床不暴露在空气的前提下，尽量使残余液体少。 4.用离心管接1ml流出液。 5.检测蛋白质时 用黑色反应板逐滴检测，直到明显白色沉淀出现，开始收集。 5.检测阴离子时 用黑色反应板逐滴检测，直到完全无沉淀。 6.加球蛋白溶液前，在胶床不暴露在空气的前提下，尽量使残余液体少。 7.用离心管接1ml流出液。 8.检测蛋白质时 用黑色反应板逐滴检测，直到明显白色沉淀出现，开始收集。 9.检测阴离子时 用黑色反应板逐滴检测，直到完全无沉淀。 10.此处蛋白质检测有一点反应就可以收集了 11.筛选浓度高低，也用磺基水杨酸鉴定 12. DEAE-纤维素柱不用再生，可直接用于纯化清蛋白 13.以下几步必须注意不同浓度的选取，区分0.06mol/l和 0.3mol/l15.反应过程比较慢可以用吸耳球适当加压醋酸纤维素薄膜电泳法步骤准备 时间原因老师替我们准备好薄膜及电泳槽50min； （4）染色 5min； 四、实验记录 （一）粗提 1.混合后离心前，成乳白、乳黄色浑浊液（如图1）； 图1 2.离心后，明显分层； 3.分离后，球蛋白经稀释后，两溶液均呈现均一无色透明状液体。 （二）脱盐 1.鉴定蛋白质过程中，白色沉淀由不显著变为明显（如图2）； 图 图 图结果与讨论γ-球蛋白纯度鉴定的电泳图谱” 图γ-球蛋白纯度鉴定的电泳图谱 2.讨论分析 清蛋白第1管点样不好，有较大弯折； 清蛋白第1管比清蛋白第2管分离效果要好，可能由于接收时操作造成； Γ-球蛋白分离效果