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实验项目二、过氧化氢酶的活力和动力学常数测定 姓 名： 凌豪 指导教师： 汪财生 实验室： 6503 组员：① 吴李伟 ② 凌豪 成绩： 第三部分：实验记录与分析 一、酶活力测定 （一）原始数据 1.样品原始质量： 豆芽菜5g 2.标定数据： （1）KMnO4质量数及配制：KMnO4质量数3.1605g 溶解配制成1000ml （2）Na2C2O4质量数：取草酸钠0.11g （3）标定数据：17.3 17.4 16.8 平均17.2 （4）KMnO4实际浓度 0.0191mol/L 3.样品滴定 酶反应组 0.25ml 0.3ml 对照组 0.7ml 0.6ml （二）结果计算 1．换算系数（1mL KMnO4溶液相当于多少mg H2O2） (0.011*1)/0.0191=4.1mg 2.样品酶活计算（每克鲜重样品1min内分解H2O2的毫克数表示：0.3mg H2O2/g?min） 二、动力学常数的测定 （一）原始数据(KMnO4=0.0191mol/L H2O2=0.11) 编号 1 2 3 4 5 消耗的KMnO4（mL） 2.1 3.5 3.8 5.7 11.45 （二）求出各管反应前的底物浓度[S]0和反应速度V0 编号 1 2 3 4 5 [S]0 （mol/L） 0.011 0.013 0.018 0.027 0.055 V0 （mmol/min） 0.0056 0.0092 0.0110 0.0172 0.0360 （三）以1/V0对1/[S]0作图（用excel作图） （四）求出Km（mol/L）和Vmax（mmol/min） Km= 3.8 Vmax=2.4 第四部分：课后研讨题 1.总结本实验操作过程的注意事项。 答：1.酶的提取和存放一般需在0-4℃进行。 2.每个三角瓶内的酶促反应时间要精确控制在5min。 3.各反应瓶的滴定终点微红色应为同一标准。 4.使用前，应检查滴定管是否渗漏，滴定过程中应该保证逐滴加入。 2.影响过氧化氢酶活力测定的因素有哪些? 答：适宜的温度 酸碱度的影响 底物浓度 3.过氧化氢酶与哪些生化过程有关? 答：过氧化氢酶存在于红细胞及某些组织内的过氧化体中，它的主要作用就是催化H2O2分解为H2O与O2，使得H2O2不至于与O2在铁螯合物作用下反应生成非常有害的-OH 4.在反应速度的测定中，加入硫酸有哪些作用？ 酸化溶液 停止反应 5.米氏方程中的Km有何实际应用？ 答：1.Km是酶的特征性常数 2. Km可用来判断酶的最适底物 3.Km可用来确定酶活性测定时所需的底物浓度 4.Km可用于判断反应级数 6.在什么条件下，酶的Km可以作为鉴定酶的一种手段，为什么？ 答：当酶促反应处于ν＝1/2 Vmax时，可从米一曼氏方程式得到Km＝〔S〕。由此可知，Km值是酶促反应速度为最大速度一半时的底物浓度。它的单位与底物浓度一样，是摩尔／升（mol/L）。 Km值对某一特定酶来说是个常数。可以利用酶的Km值比较来源于同一器官不同组织，或同一组织不同发育期的具有同样作用的酶，来判断这些酶是完全相同的酶，或是催化同一反应的一类酶。 Km值越大，酶与底物亲和力越小；Km值越小，酶与底物亲和力越大。一个酶如有几种底物就有几个Km值。其中Km值最小, Vmax/Km值最大者是对酶亲和力最大的底物，一般称为天然底物或最适底物。Km值随不同底物而异的现象，可以帮助判断酶的专一性，有助于研究酶的活性部位。 测定酶活力为什么要在进程曲线的初速度时间范围内进行？ 答：要进行酶活力测定，首先要确定酶反应时间，酶的反应时间并不是任意规定的，应该在初速度时间范围内选择。可以通过进程曲线的制作而求出酶的初速度时间范围。进程曲线是在酶反应的最适条件下采用每隔一定时间测产物生成量的方法，以酶反应时间为横坐标，产物生成量为纵坐标绘制而成。从进程曲线可知，在曲线起始一段时间内为直线，其斜率代表初速度。随反应时间延长，曲线趋于平坦，斜率变小，说明酶的反应速度下降。反应速度随反应时间的延长而降低这一现象可能是由于底物浓度的降低和产物浓度的增高致使逆反应加强等原因所致。因此，要真实反映出酶活力大小，就应在初速度时间内测定。求出酶反应初速度的时间范围是酶动力学性质的一系列研究中的组成部分和必要前提。 8.过氧化氢酶的活力测定还有另外一种方法，即紫外吸收法，原理是H2O2在240nm波长下有强烈吸收，过氧化氢酶能分解