(重组蛋白包含体的复性.docVIP

重组蛋白包含体的复性 [摘要]：重组蛋白在大肠杆菌中的高表达往往导致形成包含体。不可溶、无生物活性的包含体必须经过体外变复性才可得到生物活性蛋白。变复性实验是建立在蛋白质体外折叠机制的基础上的。近年来，随着对蛋白质折叠机制的认识，发展了不少促进蛋白折叠和二硫键氧化来提高活性蛋白产率的复性办法。 [关键词]：蛋白折叠、包含体、复性、二硫键形成 Abstract：Expression of recombinant proteins in Escherichia coli often results in the formation of insoluble inclusion bodies. Active protein can be recovered by solubilization of inclusion bodies followed by renaturation of the solubilized protein. The process of renaturation is established in the understanding to the mechanism of protein folding in vitro. In recent years, With the understanding of mechanisms of protein folding, many renaturation methods were developed, which can increase the yield of active proteins. Key word: protein folding、inclusion body 、renaturation 、the forming of disulfide bond 大肠杆菌表达系统以其操作简便，遗传背景清楚，大规模发酵成本低成为目前最常用的外源蛋白表达系统。它为许多具有药用和工业应用价值的真核生物蛋白质的获得提供了方便。但是，重组蛋白的高表达往往导致形成不溶的、没有生物活性的包含体（如人生长激素、人胰岛素和尿激酶）。 包含体的形成意味可溶性重组蛋白质的重大损失，必须经过体外变复性才能得到生物活性蛋白。如果能解决包含体的复性问题，它将是大量生产重组蛋白的最有效的途径之一。近年来对蛋白质折叠过程的深入研究使重组蛋白的体外复性取得了一系列的新进展。文章中，我们在蛋白质折叠机制的基础上，简述了重组蛋白体外复性的研究进展。 1. 蛋白质的体内折叠 细胞内的新生肽链的折叠是分阶段的，从相邻氨基酸的相互作用开始，多肽链的出现引起二级结构的形成，最后形成三级结构。Baldwin综述了蛋白质折叠起始的三种可能因素：疏水作用，二级结构及某些特殊作用力(如二硫键) [1]。实验证明，细胞内二硫键的形成速度要明显快于细胞外，而且在翻译结束之前二硫键也能够形成[2]。 近年来的一些研究表明，很多真核蛋白质的折叠和装配受到其他蛋白或酶的严格调控。在真核细胞中，蛋白可能与分子伴侣（chaperon）或折叠酶（foldase）共表达且表达量很低；也可能进行翻译后修饰分泌出去。现在已知的参与新生肽链折叠的蛋白有两类：一类是催化蛋白特定异构化的酶，限制蛋白质折叠的速度，如催化正确二硫键形成的二硫键异构酶（PDI蛋白）[3]、催化脯氨酸异构反应的脯氨酸顺反异构酶（PPI）[4]等，它们称为折叠酶，另一类辅助蛋白能与多肽链短暂暴露疏水区结合，从而防止不正确的聚集作用和错误的装配，称为分子伴侣。 重组蛋白在大肠杆菌中的折叠环境迥异于它们的天然环境－－真核细胞。 蛋白酶、氧化还原电位、PH和蛋白浓度等性质都不同[5]，而且，原核细胞不具备糖基化的功能，也没有真核细胞中相应的协助蛋白折叠的系统。当通过基因工程手段在大肠杆菌中表达外源蛋白时，额外的代谢负担给宿主细胞带来了压力，许多蛋白就会形成包含体。一般来说，处于还原环境的细菌胞质不能有效的完成二硫键蛋白质的氧化折叠[6]。也有研究表明，重组蛋白包含体的形成与蛋白质的一些主要的理化参数，如电荷平均数，易形成转角的氨基酸的含量，半胱氨酸及脯氨酸的比例，亲水性以及氨基酸总数等有关[7]。