嗜酸氧化硫杆菌的分离鉴定.docVIP

嗜酸氧化硫硫杆菌的分离鉴定 嗜酸氧化硫硫杆菌[78]（Acidithiobacillus thiooxidans At.t）是一类硫氧化细菌的总称，它们在形态学和生理学上存在着多样性，而且可能是不同种类的细菌[79]。嗜酸氧化亚铁硫杆菌（Acidithiobacillus ferrooxidans, At.f）和嗜酸氧化硫硫杆菌是目前在生物冶金方面研究最多、最重要的两种菌。氧化亚铁硫杆菌利用铁源浸矿时会在矿物表面形成硫层，阻碍进一步浸矿，而嗜酸氧化硫硫杆菌却可以利用硫，将阻碍浸矿的硫层除去[80]，因而它在浸矿中的作用尤为重要。 本文从土壤样品中分离纯化出了一株硫氧化细菌，对其进行了形态学、生理生化特征和16S rDNA鉴定和分析，为后面探讨其浸矿机理奠定基础。鉴定结果表明此菌属于嗜酸氧化硫硫杆菌，命名为HY-01。 2.1 试剂与材料 2.1.1 菌种来源 实验所用菌株为本实验室从湖北大冶铜山口酸性土壤中分离所得；大肠杆菌为本实验室保存菌种。 2.1.2 主要试剂 升华硫，化学纯，天津市福晨化学试剂厂；琼脂粉，生化试剂，国药集团化学试剂有限公司；蛋白胨，生化试剂，日本进口；酵母抽提物，生化试剂，日本进口；二苯胺磺酸钠，化学纯，国营昆山化工试剂厂；乙二胺四乙酸钠，分析纯，天津市科密欧化学试剂有限公司；其余试剂均为国药集团化学试剂有限公司分析纯。 2.1.3 培养基 实验室使用的各种培养基配方如下： Waksman 培养基[81]：(NH4)2SO4 0.2 g，K2HPO4·3H2O 3.0 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，CaCl2·2H2O 0.126 g，S0 10.0 g，蒸馏水1000 mL，pH=2.0。 Starky-Na2S2O3-琼脂培养基[81]：(NH4)2SO4 2.0 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，CaCl2·2H2O 0.25 g，KH2PO4 3.0 g，FeSO4·7H2O 0.001 g，Na2S2O3 10 g，琼脂 3.0 g，蒸馏水 1000 mL。 基础培养基：(NH4) 2SO4 0.2 g，K2HPO4·3H2O 3.0 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，CaCl2·2H2O 0.126 g，蒸馏水1000 mL，pH=2.0。 LB培养基：1 g蛋白胨，0.5 g酵母提取物，1 g NaCl，溶于100 mL蒸馏水中，pH=7.0。 2.1.4 缓冲液 STE缓冲液：Tris-HCl（pH7.6）0.2 mol/L，NaCl 0.5 mol/L，SDS 0.1%，EDTA 0.01 mol/L； TE缓冲液：Tris-HCl 10 mmol/L（pH7.6），EDTA 0.001 mol/L； 50×TAE缓冲液：242 g Tris碱，57.1 mL冰醋酸，100 mL 0.5 mol/mL EDTA(pH 8.0)，加双蒸水至1L。电泳缓冲液常用0.5×TAE缓冲液； 10%SDS溶液：10%（w/w）的十二烷基磺酸钠溶解于蒸馏水中，可加热到68℃溶解。 醋酸铵缓冲液：取醋酸铵100 g，加水300 mL使溶解，加冰醋酸7 mL，摇均即得。 2.1.5 酶及试剂盒 [1] 酶：Taq DNA 聚合酶购自武汉鼎国生物技术有限公司，T4DNA连接酶购自Takara公司，溶菌酶，蛋白酶K，Rnase，均为上海生工产品。 [2] 试剂盒：PCR产物纯化试剂盒，GenExtractTM质粒小量快速提取试剂盒，PMD-18 Vector连接试剂盒，均为Takara公司产品；DNA Marker (DL2,000)，Loading buffer购自武汉鼎国生物技术有限公司。 2.1.6 引物合成与测序 扩增16S rDNA的PCR扩增引物为： Pf：5-GAGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3 Pr：5-AAGGAGGTGATCCAGCC-3 引物由武汉鼎国生物技术有限公司合成，测序由六合华大基因科技股份有限公司完成。 2.1.7 主要仪器设备 表2.1 主要仪器与设备 Table2.1 The main equipments 型号 名称 生产厂家 3K30型 台式冷冻离心机 SIGMA SPX-250B-Z型 生化培养箱 上海博迅实业有限公司医疗设备厂 HZ200LB型 恒温培养摇床 武汉瑞华仪器设备责任有限公司 UV-2000型 紫外-可见分光光度计 龙尼柯（上海）仪器有限公司 DELTA 320 pH计 Mettle-Toledo Group（上海）有限公司 YX280A 手提式不锈钢蒸汽消毒器 上海三申医疗器械有限公司 85-2型 磁力恒温搅拌器 上海司乐仪器厂 FM70型 制冰机 格兰特公司 PCR仪 德国eppen