0403 细胞的基本培养技.pptVIP

Section 3：细胞的基本培养技术 培养操作的基本要领和要求 原代培养操作 传代培养操作 细胞计数 细胞培养应注意的问题 细胞活力的测定方法 能维持的代数一般是有限细胞系种族(主要):成纤维细胞 人,50; 猴,40; 鸡,37;鼠,8 部位:人: 胚肺 50±10; 肾8~19  猴: 肺 5; 肾 20; 耳 40条件:如表皮细胞 +EGF 从50代 增加至150年龄 模拟实验（2） 小鼠肝细胞和脾细胞原代培养两周后，进行传代培养 ◆肝细胞： ◆脾细胞： 细胞传代方法 根据细胞生长的特点，传代方法有3种： 1、悬浮生长细胞传代 离心法传代：离心（1000转/分）去上清，沉淀物加新培养液后再混匀传代。 直接传代法：悬浮细胞沉淀在瓶壁时，将上清培养液去除l/2一2/3，然后用吸管直接吹打形成细胞悬液再传代。 2、半悬浮生长细胞传代 此类细胞部分呈现贴壁生长现象，但贴壁不牢，可用直接吹打法使细胞从瓶壁脱落下来，进行传代。 3、贴壁生长细胞传代 采用酶消化法传代。常用的消化液有0.25％的胰蛋白酶液（含0.02% EDTA）。 贴壁生长细胞传代方法 1、吸尽（或倒掉）培养瓶中的培养液 2、加入1-2 ml 0.25％的胰蛋白酶液(以消化液能覆盖整个瓶底为准）静置2-10 min（显微镜下动态监测）。 3、吸去胰蛋白酶液，加入培养液（可终止胰酶的作用）。 4、用吸管吸取瓶内培养液，反复吹打瓶壁细胞，形成细胞悬液。 5、吸取1/10—1/40细胞悬液，接种于新的培养瓶内。 6、加适量新鲜培养液于接种了细胞悬液的新培养瓶内。 7、将后者放入培养箱中培养。 动物细胞的传代培养 常用细胞培养技术 ◆ 悬滴培养 ◆ 培养瓶培养 ◆ 旋转管培养 ◆ 细胞同步化培养 ◆ 克隆培养（见后） 常用培养技术 1、悬滴培养 　　也称组织块悬滴培养，是最早建立的体外培养技术，是组织和器官培养的经典方法。 　　将培养液滴于盖玻片上并铺展开，将待培养的组织或器官植块放于铺展开的培养液中央部位，然后将盖玻片翻转放于凹载玻片上，密封后进行培养。 2、培养瓶培养 　　将拟培养对象直接接种于培养瓶内再放入培养箱进行培养的方法。 3、旋转管培养 　　将所培养的组织细胞接种在一管状培养皿（称旋转管），再将旋转管置于一可旋转的装置上，边旋边进行培养的一种方法。 4、 克隆培养法 　　又称单细胞分离培养法，就是将从细胞悬浮液中获得的单个细胞用于培养，使之重新衍生成一个新细胞群体的培养技术。 　　克隆培养法强调培养产物的单一性而排除异质性，所获得的培养产物遗传产物几乎完全相同，即培养得到的后裔细胞群来源于一个共同的祖细胞，称细胞株。 Section 3：细胞的基本培养技术 培养操作的基本要领和要求 原代培养操作 传代培养操作 细胞计数 细胞培养应注意的问题 细胞活力的测定方法 细胞计数 血细胞计数板：手工计数细胞 细胞数/毫升细胞悬液＝4大格细胞总数/4×10000×稀释倍数 1毫米 计数原则： 不数死细胞（染蓝）、压线细胞数上不数下，数左不数右，一团细胞按一个计数！ Section 3：细胞的基本培养技术 培养操作的基本要领和要求 原代培养操作 传代培养操作 细胞计数 细胞培养应注意的问题 细胞活力的测定方法 细胞培养中应注意的几个问题 1）培养液和培养物的比例：一定浓度的培养液仅能支持一定数量的细胞生长，不能盲目增加每单位体积的细胞浓度。 2）pH：初培养pH应为7.4，培养过程应不低于7.0。 （耐酸不耐碱） 3）培养瓶内的空间：一般培养瓶内培养液与液面上的空间体积之比为1:10。 4）容积、深度、表面面积：培养液体积与表面面积的比例为0.2～0.5ml/cm2。需高浓度氧的，在浅的培养液（2mm）中生长较好；需要低浓度氧的。在深的培养液（5mm）中生长较好。 5）去除死细胞 6）温度控制：动物细胞培养对温度波动的敏感性很大。温度低于36.5℃，细胞生长缓慢；温度高于37.5℃，细胞存活力降低。 Section 3：细胞的基本培养技术 培养操作的基本要领和要求 原代培养操作 传代培养操作 细胞计数 细胞培养应注意的问题 细胞活力的测定方法（P28） ①细胞计数，血球计数板和电子细胞计数仪 ②生长曲线：（潜伏期，对数生长期，水平静止期）由于细胞基数和生长进度不同，生长曲线不一致。 ③细胞分裂指数，分裂细胞占全部细胞的比例 ④细胞贴壁率=贴壁存活细胞/接种细胞*100% ⑤细胞周期时间测定：用同位素标记，流式细胞仪测定细胞同期 Cell culture: Bi