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实验四 沉淀反应（二） 实验内容 免疫电泳 单向扩散电泳 一、免疫电泳 原理： 区带电泳后进行双相琼脂扩散实验。 将待测标本置于琼脂凝胶中电泳，样品中各蛋白成分因分子量及电泳迁移率不同，被分成肉眼不可见的若干区带。电泳结束后，沿与电泳方向平行的两侧开槽并加入抗血清，置室温或37度使两者扩散。18-24h后，各区带蛋白与相应的Ab在相应的位置上形成弧形沉淀线。Ag越多，沉淀线越靠近Ab 槽，其沉淀线越粗，可做细微的蛋白质组分分析，仅为定性实验。 用途： 定性实验，主要用于纯化Ag和Ab成分的分析及正常和异常免疫球蛋白的识别和鉴定等方面。 试剂和器材： 1.2%的琼脂、打孔器、小木块、小刀、 直尺、加样枪及枪头、1:2人血清 、抗人全 血清、毛滴管、湿盒、电泳槽、电泳仪等 实验方法 1. 浇板：吸热琼脂4ml浇板。 2. 打孔、挖槽（槽中琼脂暂时不取出） 3. 加样（Ag）：正常人血清10ul（1:2稀释） 4. 电泳：稳压80-100v，1h（看到电泳的位置快到 槽头左右即可）。 5. 加样（Ab:）取出后，将槽中琼脂挖出，加入抗 人全血清（不稀释）。 6. 置湿盒中，37度，18~24h，观察结果。 注意事项 1、开槽处距玻片边缘5mm,开孔处7.5mm。 2、槽中加抗血清时，加满即可，切忌溢出。 二、单向琼脂扩散电泳 原理： 单向琼脂扩散扩实验是凝胶内免疫沉淀反应定量试验。一般是用已知抗体测定未知量的相应抗原。定量抗体与加热熔化的含缓冲液的琼脂混合后，制板，打孔，加入待检抗原，在合适条件下，形成乳白色的沉淀环。 沉淀环大小与抗原（抗体）量成正相关，因而可以根据沉淀环的大小确定相应抗原（抗体）的量。 意义：单向免疫扩散试验主要用于血清中IgG、IgM、IgA和补体等蛋白质的定性、定量测定。 试剂和器材： 1.2%的琼脂、56度水浴、Ab、玻片、打孔器、直尺、加样枪及枪头、标准参考 血清、待测样本、湿盒等 实验方法 1、制备抗体琼脂凝胶板：将已知Ab加入56度保温的1.2%的琼脂中（温度不能过高，保持在56度左右），混匀。 2、 浇板：吸取4ML琼脂，快速浇于玻片上。 3、?打孔：凝固后打孔，孔径3mm，孔距10mm。 4、 加样：将标准参考血清按从小到大的浓度分别加入各孔中，同时将待检血清加入待测孔中，每孔10ul。 5、 扩散：将琼脂板平放于湿盒内，置37℃ 24～28小时后观察结果。 打孔方案 注意事项 制备抗体琼脂板时，琼脂温度必须严格控制。温度太低会导致琼脂凝固，太高将影响所加抗体的活性。 加样孔中的琼脂应挑干净，且不可损坏孔的边缘，确保每孔的液面基本一致。 * * + -- *