森林动植物检疫学(08森保)第4章 森林动植物检疫检验方法与技术解析.ppt

二、核酸杂交技术 核酸杂交是分子生物学的基本方法之一。该技术的基本原理是：采用特定的方法，标记已知微生物的核酸片段，利用该已知的核酸片段，检测待测样品中是否存在与之互补配对的核酸。该特定标记的已知微生物的核酸片段，称为核酸探针。[简单地说，核酸杂交就是用已知微生物的核酸片段（探针），检查待测样品中有没有这种已知微生物的 DNA] 核酸杂交具有敏感、特异、可同时检测大量样品等特点。杂交后的产物可干燥保存。杂交探针易于商业化生产，已广泛应用于各种植物病原的检测与鉴定。 （一）核酸探针的制备 核酸探针包括 DNA 及 RNA 探针。可用 PCR技术克隆已知微生物的核酸片段，作为探针。也可用直接提取基因组的方式，获得已知微生物的核酸片段，作为探针。探针必须是纯一的，而且必须为单链分子。 然后，对探针进行标记。标记探针的意义，在于便于检查杂交结果（通过化学发光、化学显色的方法检测）。常用的标记物如放射性同位素 32P 和非放射性的地高辛、光生物素等。可将这些标记物整合到探针的序列中。目前，主要用非放射性的物质作为标记物。 （二）核酸杂交 核酸杂交，通常在固相杂交膜，如醋酸纤维素膜和尼龙膜上进行。 先使核酸变性，完全解链， 再与探针充分杂交， 最后根据杂交信号的有无，判断杂交结果。 杂交方式，包括斑点杂交和核酸转移杂交。 斑点杂交，是将待检样品的粗提液或核酸，直接点于膜上。 核酸转移杂交，是将待检样品的核酸，用限制性内切酶剪切为大小不同的片段（限制性片段长度多态性），经琼脂糖凝胶电泳分离后，转移至膜上。 （三）DNA芯片技术 （四）限制性片段长度多态性技术（RFLP） ② 双重切接法检验。 是在休眠期，剪取鉴别寄主植物及待检树的接穗， 砧木萌发后，将带有2个芽的待检树的接穗嫁接在砧木上，然后，将鉴别寄主植物嫁接到待检接穗的上部。 为促进伤口愈合，可在嫁接后套上塑料膜保湿保温。 双重切接法嫁接成活率低，操作时应尽量仔细。 3、试管内离体微嫁接法 试管内离体微嫁接法，是检测果树病毒时常用的方法。该法比用木本指示植物检测病毒所需的时间短、检出率可靠。 该法 是以带病毒材料的试管苗做砧木，指示植物试管苗为接穗。 嫁接成活后，试管苗生根，移栽到田间。 根据指示植物上的症状，来判断所检植物是否带有病毒。 （六）血清学检测 名词： 抗原：一种能刺激人或动物机体产生抗体，并能与抗体在体内或体外，发生特异性反应的物质。细菌、病毒、毒素，都可以是抗原。 抗体：人或动物受抗原（物质）刺激后，由浆细胞（来源于淋巴细胞）合成和分泌的一种特异性蛋白质。抗体是人体抵抗外界感染的一种重要武器。 血清：指血液凝固后，在血浆中除去血纤蛋白分离出的淡黄色透明液体，或指血纤蛋白已被除去的血浆。 抗血清： 血清学检验方法快速、灵敏，操作简便，可同时进行大量样品检测，在动植物病毒、细菌检验中，应用广泛。 其原理是，抗原与其对应的抗体发生特殊结合，形成“抗原—抗体”复合物。复合物特有的沉淀现象及其理化检测特征，是鉴定病毒的有效手段。 常用的血清学方法，包括沉淀反应、凝聚反应、免疫电镜和酶联免疫吸附等。 1、沉淀反应测定 含有抗原的植物汁液与抗血清（已知）在试管中等量混合，培育后即可发生沉淀反应。在黑暗的背景下，如果可以见到絮状或致密颗粒状沉淀，即表明该植物携带有病毒。 2、凝聚反应 （琼脂扩散法） 熔化的琼脂 凝胶平板 打孔 打孔 待测植物、种子的提取液（抗原） 抗血清 沉淀带 抗原和抗体 在扩散、相遇处 如果提取液中有抗原存在，则在抗原和抗体 扩散、相遇处，形成沉淀带。该法灵敏度高，是常用的病毒检验方法。 3、免疫电镜法 该法是将病毒粒体的电镜观察和血清反应的特异性相结合，进行病毒的检测。可检测多种种传病毒。 4、酶联免疫吸附法 在血清学检验中，应用最广泛的是酶联免疫吸附法（ELISA）。该方法尤其适合植物病毒和细菌的检验。 酶联免疫吸附法有 6 种，即直接法、间接法、夹心法、竞争法、酶抗体法和双抗体夹心法。其中以双抗体夹心法（DAS—ELISA）应用最广泛。 直接酶联法 1、先将待测抗原加入微量反应板的凹孔中，在抗原被吸附后，洗涤，清除杂质，保留抗原。 2、加入特异性酶标记抗体。 3、形成“抗原—抗体（酶标记）”复合物，同时洗涤，清除掉未与抗原相结合的酶标记抗体