免疫组织化学检验技术全解.ppt

三、链霉亲和素—生物素技术 链霉亲和素与生物素的结合是已知自然界中最强的非共价相互作用之一，其功能类似亲和素。利用生物素结合的二抗与酶标记的链霉亲和素蛋白就组成酶标链霉亲和素-生物素方法（LSAB）。 LSAB法的特点:①特异性强；②分子量小，穿透力强，放大效应远超ABC法，故其敏感性更强；③等电点中性更适合组织，可明显减少非特异性染色，低背景着色使特异性着色更清晰；④操作时间缩短，更简便。 四、凝集素法 一种凝集素具有专一性结合某种特异性糖基的能力，同时所有生物膜都含有一定量的糖类，后者主要以糖蛋白和糖脂的形式存在。因此，凝集素可作为一种探针来研究细胞膜上特定的糖基。另一方面，凝集素具有多价结合能力，能与荧光素、生物素、酶、胶体金和铁蛋白等示踪物结合，从而在光镜或电镜水平显示其结合部位。 一般认为细胞膜上特定的糖基可用以区别细胞的类型并反映细胞在分化、成熟和细胞病变中的变化。 标记了相应示踪物的凝集素可用来： ①作为细胞分化和成熟的标记 ②作为细胞特殊类型的标记 ③肿瘤细胞伴有细胞膜的改变，细胞膜上的糖基也会产生相应的变化，也可用凝集素检测出肿瘤细胞。 常用下列染色法： ①直接法—标记物直接标记在凝集素上，使之直接与切片中的相应糖蛋白或糖脂相结合 ②间接法—将凝集素直接与切片中的相应糖基结合，而将标记物结合在抗凝集素抗体上 ③糖—凝集素—糖法 —本法是利用过量的凝集素与组织切片中特定的糖基相结合，经冲洗后，凝集素上还存在未被占用的结合部位，未结合部位与有过氧化物酶标记的特异性糖基相结合，形成一个“三明治样”的糖—凝集素—糖的结合物。 第五节 其他免疫组织化学检验技术 一、金免疫组织化学技术 免疫胶体金技术是以胶体金作为标记物。胶体金是指金的水溶胶，它能迅速而稳定地吸附蛋白，对蛋白的生物学活性没有明显的影响。因此，用胶体金标记一抗、二抗或其他能特异性结合免疫球蛋白的分子(如SPA)等作为探针，能对组织或细胞内的抗原进行定性、定位或定量研究。 （一）免疫金（银）光镜染色技术 基本原理是通过免疫反应沉积在抗原位置的胶体金颗粒起着一种催化剂作用，用对苯二酚还原剂将银离子(Ag＋)还原成银原子(Ag)，被还原的银原子围绕金颗粒形成一个“银壳”，“银壳”一旦形成，本身亦具有催化作用，从而使更多银离子还原并促使“银壳”不断变大，最终使抗原位置得到更清楚的放大，在光镜下就可观察到被放大的抗原位置呈现黑色或黑褐色。 （二）免疫金电镜染色技术 胶体金与镍网上待检标本的相应蛋白质发生结合，由于胶体金具有高电子密度，故金标蛋白结合处，电镜下可见黑褐色颗粒，从而可对细胞膜上或细胞内的蛋白质进行定性与定位分析。 二、酶标记免疫电镜技术 酶标记免疫电镜技术是用酶标抗体与组织或细胞抗原发生特异性结合后，加酶底物显色，在电镜下观察显色反应的强度。它是将电镜的高分辨力与酶免疫技术的特异性结合，在亚细胞和超微结构水平上对抗原物质进行定性分析的一种高度精确、灵敏的方法。 三、免疫胶体铁细胞组织化学技术 胶体铁是一种阳离子胶体，将抗体分子标记上胶体铁，通过普鲁蓝反应呈色，胶体铁颗粒有一定大小和电子密度，可用在电镜和光镜水平的抗原（抗体）的定位研究。 2.显色强度 特异性反应由于细胞内抗原含量不同，显色强度不一。阳性细胞的染色常定位于细胞，并与阴性细胞间有明显间隔 而非特异性染色常不限于单个细胞，常为成片的细胞 3.其他 在过大的组织块，中心固定不良也会导致非特异性显色 六、质量控制 质量控制是免疫组织化学检验技术取得满意结果的必要条件。 （一）试剂质量控制 抗体的质量是免疫组织化学染色成功的关键 （二）操作过程质量控制 实验操作 标本的质量控制 （三）仪器设备和器具的质量控制 第二节 酶免组织化学检验技术 酶免组织化学检验技术是在一定条件下，应用酶标抗体（抗原）与组织或细胞标本中的抗原（抗体）发生反应，然后加入酶的底物，催化底物显色，借助光镜或电镜，就可识别出标本中抗原（抗体）的分布和性质；也可通过图像分析技术达到定量的目的。 一、标本制作 常用的标本有组织切片、组织印片和细胞涂片 酶免组织化学检验技术可分为 酶标记抗体免疫组织化学染色法 非标记抗体酶免疫组织化学染色法 二、酶标记抗体的免疫组化染色法 （一）原理 酶标记抗体的免疫组织化学染色法是借助交联剂的共价键作用将酶直接连接在抗体（或抗抗体）上，酶标抗体（或抗