1基因获取、制备及鉴定.pptVIP

5、克隆 * 6、表达 * 表达产物分离纯化 Company LOGO 目的基因获取、制备和鉴定 * 北京电子科技职业学院 李晔 蛛丝是自然界最奇特的物质之一，它具有极强的韧度，其韧度是同样直径钢材的好几倍。蛛丝如果能实现大规模人工生产，将可以取代塑胶材料，用于眼部或神经外科手术的精细缝合，也可用来制造胶布等伤口包扎材料或者人造韧带及肌腱等，应用前景极其广阔。 但与家蚕不同，蜘蛛不能家养，因为它们会互相吞食，所以不可能建立人工饲养蜘蛛的农场。 ３０多年来，科学家们一直试图找到利用其他生物体来制造蛛丝的办法。在转基因细菌之前，曾有科学家尝试利用转基因山羊、转基因烟草、转基因土豆等制造蛛丝，但由于产量过低或丝质太差均未成功. 2005年左右，德国科学家日前宣布已利用转基因细菌成功制造出优质蛛丝，将来甚至能利用这种蛛丝纺织出精美布料或者制成十分结实而又异常轻巧的绳索。 利用转基因细菌制造蛛丝 家蚕能够吐出蚕丝为人类利用 能否让细菌“吐出”蚕丝？ 设想 目的基因的获得 如何将目的基因导入受体细胞 目的基因的表达 获得：获取、制备和鉴定 问题引导 1、基因重组的基本流程？ 2、基因获得处在基因重组的那一步？ 3、基因获取的方法有哪些？ 4、为什么需要制备？ 5、制备的方法有哪些？ 6、为什么要鉴定呢？ 7、如何鉴定？ * 解决问题 一、基因重组的原理及程序 二、PCR扩增 三、基因的回收 * 一、DNA重组的基本原理及程序 （DNA重组基本程序包括下列过程） 分—获取目的基因和载体 接—目的基因与载体的连接 转—重组DNA导入宿主细胞 筛—重组DNA的筛选与鉴定 举例 * （一）目的基因的获取（分） 目的基因 是指所要研究或应用的基因，也是需要克隆或表达的基因。 目的基因来源 1） 制备基因组DNA 2） 制备cDNA 3） 聚合酶链反应 4） 人工合成基因 * * 1、制备基因组DNA（基因文库， genomic library ） 分离、纯化基因组DNA 在EDTA等存在下，用蛋白 ↓RE 酶K消化细胞、酚抽提； 大小不同酶切片段 常用蔗糖梯度离心或电泳 　　　↓ 　　　　　　　　　　　　分离酶切片断； 分别与同样RE酶切的载体连接 常用噬菌体载体或质粒载体 ↓ DNA连接酶连接； 导入宿主细胞、扩增 导入宿主细胞内培养、扩增； ↓ 得到分子克隆混合体 用分子杂交等方法进行鉴定、 （基因文库） 筛选、再扩增，分离、回收。 * 2、制备cDNA （cDNA文库） 分离目的基因 的mRNA 逆转录生成cDNA单链 水解去除mRNA， 合成cDNA双链 水解回折处单链 得到平端双链cDNA 与载体连接，导入宿主细胞扩增 → 构建cDNA文库。 3、聚合酶链反应( PCR) * 在体外，以目的基因为模板，在DNA引物、dNTP、TaqDNA Pol等存在下，构成一个反应体系。经94℃变性、54℃退火及72℃延伸3个步骤的反复多次循环（25?30次），扩增目的基因（见18章）。 4、人工合成基因 应用DNA测序仪测出某一基因的碱基序列，或根据某一蛋白质的氨基酸组成反推核苷酸序列，再用DNA合成仪通过化学合成原理合成目的基因。 （一般先合成短片断DNA，然后再拼接成长片段） * （二） 目的基因与载体的连接（接） （主要有以下4种连接方式） 1) 粘性末端连接 2） 平头末端连接 3） 人工接头法 4） 同源多聚尾连接法 1、粘性末端连接 将目的基因和载体用同一种限制酶酶切，产生 相同粘性末端，再通过DNA连接酶作用将两者连接起来，构成重组DNA分子。 2、平头末端连接 有些限制酶只能将目的基因和载体DNA切割成 平端，此时在T4DNA连接酶的作用下同样能连接起 来。 * * 3、人工接头法 合成连接子→与DNA平头末端连接→限制酶切割,产生粘性末端→连接，构建重组DNA。 * 4