2016年实验仪器复习题.pptVIP

6 实时荧光定量PCR定量分析目的基因的方法 实时荧光定量PCR对待测样本中目的基因可进行绝对定量即精确定量，也可进行待测样本中目的基因相对于对照样本表达量有无改变、改变量的多少的相对定量 绝对定量是将目的基因精确标化了的标准品进行倍比稀释以后，利用标准品的浓度梯度和Ct值绘制标准曲线，再利用标准品的标准曲线和待测样本中目的基因的Ct值计算该待测样本中目的基因的浓度 相对定量是相对于对照样本（参照物）表达量的改变。常用的分析方法有双标准曲线法和△△Ct法。双标准曲线法分析时要对待测目的基因和管家基因同时做标准曲线，从而分析待测样本中目的基因相对于对照样本表达量的改变。△△Ct法是在双标准曲线分析法确定待测目的基因和管家基具有相同的扩增效率的前提下，利用对照样本和待测样本中待测目的基因和管家基因的Ct值的差值来比较分析待测样本中目的基因相对于对照样本表达量的改变 7 Western Blotting检测目标蛋白质的原理 Western Blotting是检测蛋白质混合溶液中某种特定目的蛋白质的定性、定量方法。该方法需要将组织或细胞裂解后使释放出来的蛋白质通过SDS电泳进行分离，然后将凝胶中分离开的蛋白质平行转印到NC或PVDF膜等固相载体上再与相应的特异抗体发生免疫反应。可用来确定同一蛋白质在不同细胞或同一细胞在不同条件下的相对含量。由于其检测往往需要抗体与转印到膜上的特定的目的蛋白相结合，所以被称为免疫印迹技术 8 简述Sanger双脱氧链终止法DNA测序的原理 在模板指导下，DNA聚合酶不断将dNTP加到引物的3’-OH末端，使引物延长，合成出新的互补的DNA链，如果加入双脱氧三磷酸核苷(ddNTP),由于双脱氧核糖的3’位置上缺少一个羟基，故不能同后续的dNTP形成磷酸二酯键，即形成一种全部具有相同5’-引物端和以ddNMP残基为3’端结尾的一系列长短不一片段的混合物。由于双脱氧核苷酸在每个DNA分子中掺入的位置不同，采用聚丙烯酰胺凝胶电泳区分长度差一个核苷酸单链DNA，从而读取DNA核苷酸序列 9 如何对测序报告进行简单解读及对核苷酸序列进行初步的分析 ? 删除载体及附加序列 ? 寻找基因 根据开放读码框利用软件预测或确定基因的起始密码子、信号肽、终止密码子及3’端的确认、非编码序列、内含子、密码子偏爱性、外显子--内含子边界、上游控制顺序等确定转录起始位点区，即mRNA的5’端 ? 利用生物信息学及相关软件和互联网查询或比较其同源性 ? 确定DNA顺序中基因的位置及其在基因组中的功能 10 什么是激光共聚焦显微镜？有何主要用途？ 定义：利用激光点作为荧光的激发光并通过扫描装置对标本进行连续扫描，并通过空间共轭光阑（针孔）阻挡离焦平面光线而成像的一种显微镜，是当今世界最先进的细胞生物学分析仪器 主要用途：在荧光显微镜成像的基础上加装激光扫描装置，使用紫外光或可见光、激光荧光探针，利用计算机进行图像处理，不仅可观察固定的细胞、组织切片，还可对活细胞的结构、分子、离子进行实时动态地观察和检测。激光扫描共聚焦显微技术已用于细胞形态定位、立体结构重组、动态变化过程等研究，并提供定量荧光测定、定量图像分析等实用研究手段，结合其他相关生物技术，在形态学、生理学、免疫学、遗传学等分子细胞生物学领域得到广泛应用 当细胞在非变性条件下被裂解时，完整细胞内存在的蛋白质－蛋白质间的相互作用被保留了下来。用预先固化在argarose beads上的蛋白质A的抗体免疫沉淀蛋白A，那么与蛋白A在体内结合的蛋白B也能一起沉淀下来。通过蛋白变性分离，对蛋白B进行检测，以证明两者间的相互作用 免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation，Co-IP）是以抗原和抗体的特异性作用为基础、用于研究蛋白质相互作用和确定两种蛋白质在完整细胞内相互作用的有效方法 11 免疫共沉定技术的原理及优缺点 优 点 ? 相互作用的蛋白质都是经翻译后修饰的，处于天然状态 ? 蛋白的相互作用是在自然状态下进行的，可避免人为干扰 ? 可以分离得到天然状态的相互作用蛋白复合物 局限性 ? 可能检测不到低亲和力和瞬间作用的蛋白质-蛋白质相互作用 ? 两种蛋白质的结合可能非直接结合，而是由第三者在中间起桥梁作用 ? 须在实验前预测目的蛋白，以选择最后检测的抗体，若预测不正确，实验就得不到结果 12 染色质免疫沉淀技术的原理是什么？Co-IP和ChIP两者有何区别？ 染色质免疫共沉淀（Chromatin Immunoprecipitation，ChIP）的原理：在活细胞状态下把细胞内的蛋白质和DNA交联，超声波将其随机切断为一定长度范围内的染色质小片段，然后用所研究的目的蛋白质特异性抗体免疫沉淀蛋白质-DNA复合体，从而特异性地富集