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蛋白质研究技术平台 梁洁 开放实验室 2008.6.19 蛋白质相关技术 蛋白质样品的制备 蛋白质浓度的测定 蛋白质免疫印迹（western blot) 蛋白质相互作用研究 蛋白质样品制备 单层贴壁细胞总蛋白的提取： (1)收集细胞（1*106以上） (2)加入适量含蛋白酶抑制剂的裂解液 (3)冰上裂解 (4) 4℃下12000rpm离心5min,取上清，-20 ℃保存 组织中总蛋白的提取 (1) 取组织块（约0.1g) 剪碎,加液氮磨碎、匀浆、超声处理 (2) 4℃下12000rpm离心15min,取上清，-20 ℃保存 (3)膜蛋白需用更剧烈的方法抽提，低丰度膜蛋白可能还要超滤 (4)组织中的蛋白酶活性更强，需要注意抑制蛋白酶的活性 蛋白质浓度测定 Bradford蛋白浓度测定试剂盒 1.完全溶解蛋白标准品，取10?l稀释至100?l ，使终浓度为0.5mg/ml。可以用0.9%NaCl或PBS稀释标准品。 2.将标准品按0, 1, 2, 4, 8, 12, 16, 20微升分别加到96孔板中，加标准品稀释液补足到20微升。 3.? 加适当体积样品到96孔板的样品孔中，加标准品稀释液到20微升。 4.? 各孔加入200微升G250染色液，室温放置3-5分钟。 5.? 用酶标仪测定A595，或560-610nm之间的其它波长的吸光度。 6.? 根据标准曲线计算出样品中的蛋白浓度。 蛋白质核酸测定仪 蛋白质免疫印迹(WB)原理 蛋白质免疫印迹（WB)过程 蛋白质免疫印迹（WB)过程 SDS所需仪器 SDS聚丙烯酰胺凝胶（SDS)的有效分离范围 配胶所需材料 蛋白质转印槽 Western blot 所需材料 还原型5×SDS上样缓冲液 5×电泳液缓冲液 浸渍式转移缓冲液或半干式转移缓冲液 TBST或PBST缓冲液 封闭液（抗体稀释液） 洗脱抗体缓冲液 化学发光试剂（ECL） 显影液和定影液 抗体 Mark Western blot 操作流程 配胶：根据蛋白质分子量配制相应浓度的SDS电泳：以5－100μg蛋白量上样，电泳至溴酚兰跑到底部。 转印：剪下适当大小的PVDF膜，把胶铺在负极滤纸上，上面小心覆盖泡好的PVDF膜，夹好后倒入电转缓冲液，加入冰格，100V转移1小时。 封闭：膜加封闭液（5％脱脂牛奶in TBS-T）, 室温1h. 抗体孵育：加一抗（1：1000）4℃孵育过夜，TBST洗三次，3x10min；加二抗（1：20000） 室温1h，TBS-T洗三次，3x10min； 显影：膜上加同体积ECL A，B液（100μl/cm2),依照荧光强度而定曝光时间，显影1、5、15min,定影10min. 保存：X-胶片干后，将分子量和加样顺序标记上，把日期，抗体名称，孵育时间写上。把膜保存在－20℃以备以后使用。 SDS常见问题 纹理和脱尾现象：样品溶解不佳，加样前离心 蛋白带过宽：邻近泳道的蛋白加样量过多 指示剂成微笑符号：凝胶不均匀冷却 指示剂成哭泣符号：凝胶和玻璃板组成“三明治”底部有气泡 凝胶时间不对：凝胶太慢可能是TEMED、 APS剂量不足或失效；凝胶太快：TEMED、 APS用量过多，胶太硬易裂 Western blot 常见问题 Western blot 常见问题 Western blot 常见问题 Western blot 常见问题 Western blot常见问题 Western blot常见问题 免疫组化和Western Blot可以用同一种抗体吗？ 解答：免疫组化时抗体识别的是未经变性处理的抗原决定簇（又称表位），有些表位是线性的，而有的属于构象型；线性表位不受蛋白变性的影响，天然蛋白和煮后的蛋白都含有；构象型表位由于受蛋白空间结构限制，煮后变性会消失。如果抗体识别的是蛋白上连续的几个氨基酸，也就是线性表位，那么这种抗体可同时用于免疫组化和Western，而如果抗体识别构象形表位，则只能用于免疫组化。一般抗体说明书上都有注明此种抗体识别的氨基酸区间。 Western blot常见问题 在做Western Blot时，PBDF膜用甲醇浸泡的目的？ 解答：PVDF膜用甲醇泡的目的是为了活化PVDF膜上面的正电基团，使它更容易跟带负电的蛋白质结合，做小分子的蛋白转移时多加甲醇也是这个目的。 Western blot常见问题 不能很好地将大分子量蛋白转移到膜上， 转移效率低怎么样解决？ 解答：可以考虑：转移缓冲液中加入20%甲醇（是指终浓度）(优化的转移缓冲液，可以参考《蛋白质技术手册》)，因为甲醇可降低蛋白质洗脱效率，但可增加蛋白质和PVDF膜的结合能力，甲醇可以防止凝胶变形，甲醇对高分子量蛋白质可延长转移时间；转移缓冲液加入终浓度0.1%SDS，也是为了增加转移效率；用优质