分子生物研究法(上).ppt

免疫印迹法程序可分为五个部分： 蛋白样品的制备 经过SDS分离的样品 分离的蛋白转移到膜载体上，转移后将膜上未反应的位点封闭起来以抑制抗体的非特异性吸附 用固定在膜上的蛋白作为抗原，与对应的非标记抗体（一抗）结合 洗去未结合的一抗，加入酶偶联或放射性标记的二抗，通过显色或放射自显影来检测蛋白。 用于二级抗体的检测有以下三种： 放射性标记的抗体 与酶偶联的抗体 与生物素相偶联的抗体 5.6.3 蛋白质质谱分析技术 　　蛋白质组学中最有意义的突破是用生物质谱鉴定电泳后分离的蛋白质。该技术是一种超灵敏的技术，从理论上说，仅需少量样品就可获得误率低于百万分之一的结果。 6.6 其他分子生物学技术 6.6.1 凝胶滞缓实验 凝胶滞缓试验（gel retardation assay）， 又叫作DNA迁移率变动试验（electophoretic mobility shift assay,EMSA），是用于体外研究DNA与蛋白质相互作用的一种特殊的凝胶电泳技术。 在凝胶电泳中，由于电场的作用，裸露的DNA朝正电极移动的距离与其分子量的对数成反比。如果此时DNA分子与某种蛋白质相结合，那么，由于分子量增大，它在凝胶中的迁移作用便会受到阻滞，在特定电压和时间内朝正电 极移动的距离也就相应缩短了。 凝胶阻滞实验的基本原理图 放射性标记的DNA由于与一种细胞蛋白质B结合，于是在凝胶电泳中移动速度变慢，在放射自显影中呈现滞后的条带 A C B 放射自显影 * * * * 凝胶电泳 放射性标记的DNA 细胞蛋白质提取物 蛋白质与DNA结合 * * * * * * B DNA-蛋白质结合物电泳迁移缓慢 滞后带表明DNA与蛋白质结合 在离体条件下，菠菜叶绿体蛋白与高粱psbA基因启动子“-35”元件(TTGACA) 及其突变体(ATTACT)的结合效应： A－自由DNA探针；B～F—逐步增加野生型DNA探针量而保持菠菜叶绿体蛋白提取物量不变；G－以突变子ATTACA作为DNA探针，蛋白质的量同F值 科学通报 VOL-44-99-12，吴乃虎等 菠菜叶绿体蛋白质提取物与高粱psbA启动子DNA的竞争结合实验：A～E——未标记的竞争DNA量分别是标记DNA探针量的1，5，10，30，50倍。  科学通报 VOL-44-99-12，吴乃虎等 拟南芥转录 因子与不同DNA元件有不同的结合能力。 6.6.2 噬菌体展示技术 噬菌体是细菌病毒的总称，英文为 Bacteriophage，来源于希腊文“phagos”， 有“吞噬”之意。 噬菌体可被分为溶菌周期和溶源周期两种不同 的类型。在溶菌周期，噬菌体将其感染的宿主 细胞转变成为噬菌体的“制造厂”，产生出大量 的子代噬菌体颗粒。实验室常将只具有溶菌生长周期的噬菌体叫作烈性噬菌体。 溶源生长周期是指噬菌体DNA被整合到宿主细胞染色体DNA上，成为它的一个组成部分，感染过程中不产生子代噬菌体颗粒。具有这种溶源周期的噬菌体被称为温和噬菌体。 噬菌体展示技术的基本原理是将编码“诱饵”蛋 白的DNA片段插入噬菌体基因组，并使之与噬 菌体外壳蛋白编码基因相融合。重组噬菌体侵染宿主细菌后，复制形成大量带有杂合外壳蛋白的噬菌体颗粒，直接用于捕获靶蛋白库中与 “诱饵”相互作用的蛋白质。 6.6.3 蛋白质磷酸化分析技术 由于细胞内可能有多达上千个蛋白激酶，体内检测某个蛋白激酶活性非常困难，科学家常用体外激酶活性分析法来检测蛋白激酶活性。该方法能十分可靠地鉴定某个蛋白激酶对底物的磷酸化作用，筛查激酶的特异性底物。 1）半保留复制方式 2）半不连续复制 3） DNA 螺旋酶 4） RNA 引物 1） 复制起点（单、多） 2）复制子（大小、多少） 3）复制叉移动的速度 4）冈崎片段的大小 5）端粒和端粒酶 6）DNA聚合酶 相同点： 不同点： 原核生物和真核生物DNA复制的比较 * 转导是通过缺陷phage来传递DNA片段，转染是提纯的病毒核酸侵染细胞后能产生正常病毒的现象。转化是受体菌直接接受拱体菌DNA片段而获得后者部分遗传性状的现象。  * 将经过转化后的细胞在选择性培养基中培养，才能较容易地筛选出转化体，即带有异源DNA分子的受体细胞。否则，如果将转化后的菌液涂在无选择性抗生素的培养基平板上，会出现成千上万的细菌菌落，将难以确认哪一个克隆含有转化的质粒。虽然只有那些含有被转化质粒的细菌才能在含有抗生素的平板上生长和繁殖，但对于连接混合物而言，此时并不能确定哪个克隆含有插入片段。 因为许多载体都带有一个LacZ基因的调控序列和头146个氨基酸的编码信息，编码?-互补肽，该肽段能与宿主编码的缺陷型?-半乳糖苷酶实现基因内互补（ ?-互补）。当这种载体转入可编码?－半乳糖苷酶C端部分序列