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现代生物学实验技术实验报告 实验一、超薄切片 一、实验目的 学习掌握常规生物样品前处理技术及样品包埋块的制备技术。 二、实验材料 植物幼嫩叶片、小鼠肝脏细胞 三、实验试剂 2.5％戊二醛、PBS、1％锇酸、30％丙酮、100％丙酮、Epon812包埋液、蜡油 四、实验器材 离心管、玻璃棒、滴管、移液枪、刀片、镊子、牙签、烘箱、切片机、 五、实验步骤 1、取材固定：从植株上取叶片或者取小鼠肝脏细胞，切取1mm3左右大小的组织块，立即放入PBS（pH7.2)配制的2.5%戊二醛中固定1小时。 2、用0.1molPBS缓冲液冲洗三次每次3～5分钟。 3、1％锇酸固定1小时，然后用缓冲液冲洗三次每次3～5分钟。 4、丙酮脱水：30％－50％－70％－80％－90％－100％－100％ 每级5～10分钟 5、浸透：脱水剂：包埋剂=3：1 1小时 脱水剂：包埋剂=1：3 过 夜 6、聚合：45 ℃ 12h 60 ℃ 24h 磷酸缓冲液 0.2molL-1 PBS 配制 A液：Na2HPO4 .2H2O 35.61g 加DDW 至 1000ml B液：NaH2PO4 .H2O 27.6g 加DDW 至 1000ml 不同pH磷酸缓冲液的配制 pH 6.6 6.8 7.0 7.2 7.4 7.6 A液(ml) 18.8 24.5 30.5 36.0 40.5 43.5 B液(ml) 31.2 25.5 19.5 14.0 9.5 6.5 Epon812包埋液的配制 Epon812树脂 20ml DDSA 4.6ml MNA 15.3ml DMP-30 0.8ml 2、支持膜的制备 将一个干净的载玻片垂直放入含有0.3~0.5%氯仿配制的聚乙烯醇缩甲醛制模剂中，放置两三秒后将载玻片垂直取出。用刀片在含有膜的载玻片上划出所需要的正方形，然后将载玻片45度倾斜放入水溶液中，使膜飘在水面上，选取厚薄合适的膜，将膜放在载网上，以备后面用。 3、切片 首先制刀，将玻璃片制成梯形的刀片，以备切片时使用。将包埋块置于显微镜下进行修整，将其修为最上端为正方体。在切片机上进行切片操作，使切下来的样品片漂浮在水槽中。对切下来的样品块进行染色并观察。 六、注意事项 1、取材的时候动作要迅速，组织离体后应将其快速放入固定液中。并且要尽量减少损伤，减少牵拉或挤压组织。组织块的大小一般为1mm3。 2、用固定液固定的样品若漂浮在溶液表面，应通过抽真空的方法让样品沉入溶液中。 3、饿酸为剧毒、极易挥发的试剂，使用时要注意安全。 4、脱水时要逐级脱水，而不能急剧脱水，更换液体时动作要快，不要让组织离开溶液，否则会在组织内外产生气泡。 5、在制备支持膜的时候手一定要稳，不能抖动，这样制出的膜才会厚薄均一。在将载玻片浸水的时候要缓慢入水，这样才会使膜利用水的张力慢慢的离开载玻片，漂浮在水面上。 实验二、投射和扫描电镜 一、实验目的 1、掌握透射电子显微镜的成像基本原理及其应用 2、掌握扫描电子显微镜的成像基本原理及其应用 二、实验原理 1、透射电子显微镜的成像基本原理 在真空条件下，电子束经高压加速后，穿透样品时形成散射电子和透射电子，它们在电磁透镜的作用下在荧光屏上成像。 2、扫描电子显微镜的成像基本原理 利用二次电子信号成像来观察样品的表面形态。电子“探针”扫描，激发样品表面放出二次电子，探测器收集二次电子成像。 三、主要电镜制样技术 1、超薄切片技术 用于电镜观察的样本制备 2、负染色技术 染色背景，衬托出样品的精细结构 3、冰冻蚀刻技术 冰冻断裂与蚀刻复型：主要用来观察膜断裂面的蛋白质颗粒和膜表面结构。 4、电镜三维重构技术 电子显微术、电子衍射与计算机图象处理相结合而形成的具有重要应用前景的一门新技术。 电镜三维重构技术与X-射线晶体衍射技术及核磁共振分析技术相结合，是当前结构生物学（主要研究生物大分子空间结构及其相互关系）的主要实验手段。 实验三、胶体金的制备 实验原理 氯金酸(HAuCl4)在还原剂作用下，可聚合成一定大小