土壤参考酶的测定方法.docVIP

一、脲酶测定(比色法) 脲酶是对尿素转化起关键作用的酶，它的酶促反应产物是可供植物利用的氮源，它的活性可以用来表示土壤供氮能力。 1、试剂配制： pH6.7柠檬酸盐溶液：取368g柠檬酸溶于600mL蒸馏水中，另取295g氢氧化钾溶于水，再将两种溶液合并，用1N氢氧化钠将pH调至6.7，并用水稀释至2L。 苯酚钠溶液：称取62.5g苯酚溶于少量乙醇中，加2mL甲醇和18.5mL丙酮，后用乙醇稀释至100mL（A液），保存再冰箱中。称取27g氢氧化钠溶于100mL水中（B液），保存于冰箱中。使用前，取A、B两液各20mL混和，并用蒸馏水稀释至100mL备用。 次氯酸钠溶液：用水稀释制剂至活性氯的浓度为0.9％，溶液稳定。 10％尿素溶液：10g尿素溶于100mL水中。 N的标准溶液：精确称取0.4717g硫酸铵溶于水稀释至1L，则得1mL含0.1mgN的标液，再将此液稀释10倍制成氮工作液（0.01mg/mL）。 2、操作步骤 称取5ｇ土置于50mL容量瓶中,加1mL甲苯处理,加塞塞紧轻摇15ｍｉｎ;往瓶中加入5mL10%尿素液和10mL的柠檬酸盐缓冲液(ｐＨ6.7),仔细混匀。在37℃恒温箱中培养24ｈ。然后用热至38℃的蒸馏水稀释至刻度(甲苯应浮在刻度以上),摇荡,将悬液过滤。取滤液1mL置于50mL容量瓶中,用蒸馏水稀释至10mL,然后加入4mL苯酚钠溶液,并立即加入3mL次氯酸钠溶液，加入每一试剂后,立即将混合物摇匀,20ｍｉｎ后,将混合物稀释至刻度,在波长578ｎｍ处测定吸光值。脲酶活性以样品所得的吸光值减去对照样品吸光值之差,根据标准曲线求出氨态氮量。 标准曲线绘制：分别取0、1、3、5、7、9、11、13mL氮工作液置于50mL容量瓶中，加蒸馏水至20mL，再加4mL苯酚钠溶液和3mL次氯酸钠溶液，随加随摇匀，20min后显色，定容。1h内再分光光度计上于578nm处比色。 3、结果计算 以24小时后1g土壤中NH3－N的质量（mg）表示脲酶活性（Ure） Ure＝a·V·n/m 式中：a为由标准曲线求得的NH3－N浓度（mg/mL）；V为显色液体积（50mL）；n为分取倍数；m为烘干土重（g）。 二. 过氧化氢酶测定(容量法)（比较好测） 1. 试剂配制 a. 0.3％过氧化氢溶液：按1:100将30%H2O2用水稀释 b. 3N 硫酸（？？？？？？？？？？？） c. 0.1N 高锰酸钾（1/5KMnO4）溶液：称取化学纯高锰酸钾3.161g，溶于1升无CO2蒸馏水中，贮于综色瓶中，备用。 2. 操作步骤 （1）取2g风干土，置于100mL三角瓶中，并注入40mL蒸馏水和5mL 0.3％H2O2溶液。 （2）同时设置对照，即三角瓶中注入40mL蒸馏水和5mL 0.3％过氧化氢溶液，而不加土样。 （3）将三角瓶放在振荡机上振荡20min后，加入5mL3N硫酸，以稳定未分解的过氧化氢。再将瓶中悬液用慢速滤纸过滤。吸取25mL滤液，用0.1N高锰酸钾滴定至淡粉红色终点。 3. 结果计算 用于滴定土壤滤液所消耗的高锰酸钾量（毫升数）为B，用于滴定25mL原始的过氧化氢混合液所消耗的高锰酸钾量（毫升数）为A。 （A-B）×T即为过氧化氢酶活性。以20min后1g土壤的0.1N高锰酸钾的毫升数表示。（？？？？）式中T为高锰酸钾滴定度的校正值。（就是最后换算成每克，所以还要测土壤含水量） 高锰酸钾溶液标定称取0.2g（准至0.0001g）于105~110℃烘至恒重的基准草酸钠。溶于100mL（8+92）硫酸溶液中，用配制好的高锰酸钾溶液[c（KMnO4）=0.1mol/l]滴定，近终点时加热至65℃，继续滴定至溶液呈粉红色保持30s，同时作空白试验。 高锰酸钾溶液标准浓度按下式计算c（1/5KMnO4）=m/（V1-V2）*0.06700式中????????? c（1/5KMnO4）=—高锰酸钾标准液之物质的量浓度，mol/L；???????????????? m——草酸钠之质量，g；????????????????? V1——高锰酸钾溶液之用量，mL；?????????????????? V2——空白试验用高锰酸钾溶液之用量，mL；????????0.06700——与1.00mL高锰酸钾溶液c（1/5KMnO4）=1.000mol/l相当的以克表示的草酸钠的质量。 三、蔗糖酶测定（比色法）： 1、试剂配制 （1）3，5－二硝基水杨酸溶液：称0.5g二硝基水杨酸，溶于20mL2N氢氧化钠和50mL水中，再加30g酒石酸钾钠，用水稀释至100mL（不超过7天）。 （2）pH5.5磷酸缓冲液：1/15M磷酸氢二钠（23.876g磷酸氢二钠.12H2O溶于1L蒸馏水中）0.5