遗传学实验八-果蝇基因组DNA提取讲解.pptVIP

实验八、果蝇基因组DNA的提取 一、实验目的 通过实验掌握动物基因组DNA抽提的操作过程，了解DNA提取的意义。 预备知识 核酸是重要的生物大分子之一，脱氧核糖核酸（DNA）是核酸的一种，DNA是绝大多数生物（除少数RNA病毒外）记录、存储、传递遗传信息的分子。近年来，分子生物学技术迅速发展，在分子遗传学研究领域的诸多方面涉及到抽提基因组DNA的方法。DNA的提取是进行PCR扩增、Southern杂交、限制性片段长度多态性分析等实验的基础。 三、实验材料 新鲜存活的果蝇或－20℃冻存1h的果蝇个体5～10个。 四、实验仪器及用具 器具：玻璃棒、烧杯、离心管、量筒、分析天平、水浴锅、台式高速离心机、4℃冰箱、长玻璃吸管、微量加样器、枪头、紫外分析仪、琼脂糖电泳装置。 五、药品和试剂 酚（Tris饱和酚）、氯仿、异戊醇、十二烷基硫酸钠(SDS)、Tris 碱、乙二胺四乙酸（EDTA）、异丙醇。 溶液配制： 消化缓冲液：含100mM的Nacl，10mM Tris.cl（PH8.0）, 25mM的EDTA（PH8.0）, 0.5％的SDS。 TE缓冲液（PH8.0）：含10mM Tris.cl（PH8.0）,1mM的EDTA（PH8.0）。 电泳缓冲液TAE： 电泳缓冲液（50×TAE）：取Tris24.2g ，冰醋酸 5.7ml，0.25mol/L EDTA (pH8.0)20ml ，加蒸馏水至 100ml。1×TAE 为配制琼脂糖凝胶及其电泳的应用缓冲液。 0.7％琼脂糖凝胶的配制：称取0.28g琼脂糖，加入40ml 1×TAE，于电炉上加热至沸腾，待凝胶冷却至50℃左右（手试微烫），加入3μl GoldViewTW荧光染料，混匀后将胶倒入插好梳子的制胶板上，冷却后备用。 六、实验步骤 1）取6只麻醉的果蝇（让乙醚挥发干净）放入1.5ml离心管中，加入消化缓冲液30μl，用200μl Tip枪头迅速捣碎。 2）补加消化缓冲液400μl，混匀，置65℃温浴30分钟每10分钟摇荡一次，以使样品被充分消化。 3）取出离心管加入400μl酚，400μl氯仿：异戊醇（24：1）的混合物，盖紧管盖，上下颠倒充分混匀，抽提样品5min,12000rpm离心5分钟。 4）小心吸取上清转移至新的离心管中。加入400μl异丙醇，轻轻混匀3min，此时可见白色线团状物质出现。 5）14000rpm离心10分钟，让线团状物质沉到管底或管壁，小心倒出液体。 6）用400μl 70％的乙醇洗涤沉淀，12000rpm离心5min,倒掉乙醇，倒置晾干至乙醇味道消失，沉淀用50μl TE 缓冲液溶解。 7）取5-8μl DNA溶液,与2μl上样buffer混合,然后上样于0.7％的琼脂糖凝胶上，120伏电压下电泳30min。 8）将琼脂糖凝胶置于紫外分析仪中观察DNA条带的绿色荧光。 注意事项： A 实验前将部分药品（酚、氯仿、异戊 醇、异丙醇）4℃预冷。 B 消化液要预热,以抑制DNase,加速蛋白变性,促进 DNA溶解C 避免在操作过程中机械振动过于剧烈，以免 造成DNA的断裂。 D 使用离心机要注意安全，先定时，再将转速 从零慢慢增大。 E 乙醇洗涤DNA后一定要晾干，否则电泳点 样时样品容易上漂。 基因组DNA的提取图片 * * 《遗传学实验》 深圳大学生命科学学院 实验楼205 二、实验原理 使用消化缓冲液使DNA从细胞内释放出来，65度温育可以加速DNA溶解，酚——氯仿异戊醇抽提可以将蛋白质与DNA分离，冷的异丙醇沉淀DNA，70％的乙醇洗去DNA表面的残留有机溶剂。