酯精典课件酶与氧化酶.pptVIP

√　（快） － 苯甲酰胆碱 √　（快） － 长链脂肪酸胆碱 － √ 乙酰-β-基甲基胆碱 √ 高浓度不抑制其活性 √（快） 高浓度时抑制其活性 乙酰胆碱 胆碱酯酶 乙酰胆碱酯酶 AChE 和 ChE　的底物特异性 （一）显示方法——亚铁氰化铜法 1、反应原理 　　利用乙酰胆碱酯酶能将乙酰胆碱盐水解产生硫代胆碱，使铁氰化物还原为亚铁氰化物，再与铜离子结合形成亚铁氰化铜显色沉淀，证明酶活性的存在。　　 乙酰胆碱盐 AChE 硫代胆碱 若用四异丙基焦磷酰胺抑制胆碱酯酶，可单独显示乙酰胆碱酯酶。 铁氰化钾 亚铁氰化钾+Cu2+ 亚铁氰化铜 ２、孵育液 　乙酰硫代胆碱碘盐 5mg 　0.1mol/L醋酸缓冲液pH5.5 6.5ml 　0.1mol/L (2.94%) 柠檬酸钠 0.5ml 　30mmol/L (0.75%) CuSO4 1.0ml 　5mmol/L (0.164%) 铁氰化钾 1.0ml 蒸馏水 1.0ml 　　乙酰胆碱碘盐完全溶解于醋酸缓冲液后，依次加入其它溶液，临用前不超过30分钟内配制，充分混匀，至溶液呈亮绿色，最终pH5.5。 ３、操作步骤 (1) 新鲜组织恒冷箱切片； (2)冷丙酮或10%福尔马林固定20-25min； (3)蒸馏水洗； (4)入孵育液37℃，１h； (5)蒸馏水洗； (6)甘油明胶封固。 ４、结果与评价 　　乙酰胆碱酯酶和胆碱酯酶活性部位显棕色沉淀。 Cu2+浓度太小易弥散，pH5-5.5，高于６易扩散。 ５、对照 　　用四异丙基焦磷酰胺4mM(0.137%) 0.2ml抑制胆碱酯酶显示乙酰胆碱酯酶； 　　用毒扁豆碱硫酸酯3×10-5M代替蒸馏水，先将切片处理30分，水洗后入孵育液，则二种酶均被抑制呈阴性。 (二）生物学意义 　　胆碱酯酶的活性中心是丝氨酸。乙酰胆碱酯酶活性的强弱是神经细胞性质和功能的重要参考指标，亦是神经系统发生过程中的神经细胞分化的一个指标，所以在形态上将乙酰胆碱酯酶的组织化学显示作为胆碱能传递部位的标志。 AChE是生物神经传导中的一种关键性的酶，在胆碱能突触间，该酶降解乙酰胆碱，终止神经递质对突触后膜的兴奋作用，保证神经信号在生物体内的正常传递。 AChE与细胞凋亡有一定的关系。在细胞水平发现实验所用的各类细胞，正常状态没有AChE活性反应，一旦发生凋亡，都有AChE活性反应。用其特异的抑制剂可以抑制其活性反应。用RT-PCR方法证明了凋亡细胞有AChEmRNA的转录。加入其抑制剂石杉碱可降低凋亡基因的表达。 　　乙酰胆碱酯酶主要分布于神经系统（大脑皮质中有AChE阳性的神经纤维，还存在于胆碱能神经元中）、神经肌肉接头处、红细胞等，而胆碱酯酶主要分布于血清、胰腺、唾液腺内。 五、胆碱乙酰转移酶 (choline acetyltransferase, ChAc) 此酶不属于羧酸酯水解酶，它是乙酰胆碱的合成酶。胆碱乙酰转移酶的强弱是胆碱能神经生理功能的标志，因此将ChAC确认为胆碱能神经的标志酶。 （一）显示方法——Burt法 1、反应原理 胆碱乙酰转移酶可把乙酰胆碱辅酶A的乙酰基转移到胆碱分子上,合成乙酰胆碱。辅酶A被游离出来，辅酶A中的—SH被铅离子沉淀而显示酶的活性。 乙酰辅酶A+胆碱 乙酰胆碱+辅酶A Pb2+ 沉淀产物 PbS↓ 硫化铵 ChAc 2、孵育液 25mmol/L N-2-羟基乙基哌嗪-N-2-乙烷磺酸缓冲 液（HEPES） pH6.0 4mmol/L 胆碱（48.5mg/100ml缓冲液） 0.2mmol/L 乙酰胆碱辅酶A（16.2mg/100ml缓冲液） 18mmol/L 硝酸铅（59.6mg/100ml缓冲液） 0.1mmol/L Phospholine iodide(乙酰胆碱酯酶抑 制剂）（3.8mg/100 ml缓冲液） 最终pH值为6.0。 3、操作步骤 （1）固定：8μm厚的冰冻切片在10%蔗糖和2%戊二醛的25mmol/LHEPES缓冲液（pH7.0）中固定5min； （2）漂洗：用含10%蔗糖的HEPES缓冲液洗15min×3； （3）孵育：切片入孵育液中，室温，3h；（30℃，15-30min）； （4）蒸馏水洗3次； （5）1%硫化铵显色2min； （6）缓冲液漂洗，甘油明胶封固。 4、结果：酶活性部位呈黑色沉淀。 5、对照： （1）孵育液中可除去辅酶A； （2）孵育液中去除胆碱，反应结果为阴性