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基因治疗 一、基因治疗的概念及遵循原则 二、基因治疗的程序 三、基因治疗的策略 四、基因治疗的临床应用 五、基因治疗的问题与前景 基因治疗的概念 定义：向靶细胞或组织中引入外源基因DNA或RNA片断，以纠正或补偿基因的缺陷，关闭或抑制异常表达的基因，从而达到治疗的目的。 出于伦理、安全性和技术性的考虑，现在多是针对体细胞的治疗。 基因治疗常采取： (1)基因置换(gene replacement) (2)基因修正(gene correction) (3)基因修饰(gene augmentation) (4)基因失活(gene inactivation) 基因置换 基因置换(gene replacement)：是指将致病基因整个地被有功能的正常基因所置换，使致病基因永久地得到更正。但操作难度大，有伦理学问题。 基因修正 基因修正(gene correction)是指将致病基因的突变碱基序列得以纠正，而正常序列部分予以保留，使突变的致病基因恢复正常功能。即使致病基因的突变序列纠正为正常序列（用碱基点突变技术）。 基因敲除knock-out :使基因组中某个/某几个基因或基因的顺时元件产生缺陷，从而在突变体内丧失正常的功能，来探测这些基因或元件原来在体内的功能。 基因敲入knock-in ：在个体的基因组中定点加入了某个/某几个基因或基因的顺时元件，使之表达或发挥作用，从而研究该基因或顺时元件在体内的功能，或用该基因揭示相邻基因的表达规律等。 基因修饰 基因修饰(gene augmentation)则是指将目的基因导入缺陷细胞或其它细胞，目的基因的表达产物可修饰和改变缺陷细胞的功能或使原有的功能得到加强。 基因失活 基因失活(gene inactivation)：应用反义技术(antisense technology)特异封闭某些基因的表达，以达到抑制或阻止某些有害基因的表达。 SiRNA的基因干扰可造成靶基因（异常基因）的失活（或沉默）。 基因治疗遵循的原则 1．治疗的疾病应是指目前治疗方法难以阻止疾病发展的严重疾病。 2．遗传性疾病应是属于染色体“隐性”遗传的疾病，即指来自双亲的二条染色体上同一基因位点都发生改变的疾病，只要通过导入同一正常基因即可纠正缺陷。 3．能治疗疾病的正常基因已经被克隆，并能表达有功能的产物。 4．基因治疗用的基因在体内表达无需精确调控，表达产物过多不会产生危害。 5．注入体内带有外源基因的治疗细胞，应能自然消减去除。 二、基因治疗的程序 (一)目的基因的准备 (二)受体细胞(靶细胞)的选择和培养。 (三)载体的选择 (四)目的基因导入靶细胞的基因转移方法 目的基因导入靶细胞的基因转移方法 1．基因转移的物理法 2．基因转移的化学法 3．基因转移的融合法 4．基因转移的颗粒轰击技术 5．基因转移的病毒载体法 1．基因转移的物理法 2．基因转移的化学法 (1)DNA—磷酸钙共沉淀法 Transfection of DNA by calcium phosphate coprecipitation 基因加氯化钙再加入Hepes形成DNA-磷酸钙沉淀颗粒，被细胞吞入。 2 DEAE—葡聚糖法 基因加DEAE-dextron，形成复合物，被细胞吞入或先用DEAE处理细胞再加DNA，而后被吞入。 3 染色体介导法 收集分裂中期染色体，用磷酸钙共沉淀法导入。 4 聚阳离子—DMSO转染技术 先用DMSO处理细胞（改变通透性），再加入聚阳离子处理的DNA（增加细胞表面吸附能力） 3．基因转移的融合法 1 细胞融合法 PEG/仙台病毒使供/受细胞融合。 2 脂质体介导法 脂质体包被基因DNA后，加入PEG预处理的受体细胞，使细胞融合。 3 原生质体融合法 将目的基因质粒重组菌制成感受态，在溶菌酶作用下，释放原生质体，再加入原先用PEG处理的受体细胞，发生原生质体与受体细胞融合。 4 微细胞核介导法 供体细胞先用秋水仙素处理，再用细胞松弛素处理（脱核），制成微核细胞，再加PEG处理的受体细胞，再进行细胞融合。 目的基因的准备 其表达产物已证明有活性，功能确切，在启动子下游可表达，有标记基因筛选，监控重组体。 受体细胞的选择和培养 易取材，易培养，基因易导入，对载体敏感，可培养传代，寿命相对较长。能达足够量，如疾病细胞，造血细胞、基质细胞、上皮、成纤维、内皮细胞等。 载体的选择 质粒载体既具有动物（人）细胞表达元件，又具有细菌质粒相关元件。 病毒载体：1.重组病毒载体：基因重组病毒可直接感染细胞导入基因 2.重组质粒型病毒载体：在细菌中扩增质粒，体外包装形成假病毒，感染靶细胞，将基因导入。 4．基因转移的颗粒轰击技术 基因枪法最早是由美国康奈尔大学的Sanford最