第三章转基因生物和基因打靶幻灯片.ppt

第一节 转基因动物 上海转基因动物 遍体白色，颈下的两个肉垂特征明显，除了 个头略有大小，长得就像“孪生三兄弟” （二）重组载体的构建 选择合适的基因载体，要求载体序列不干扰外源基 因的表达、能接受外源DNA容量大小、稳定、对宿 主细胞无威胁。 （三）重组载体的体外验证（in vitro） 重组载体的正确性验证，如拷贝数、连接方向等。 对于连有组织特异性启动子或局部体细胞转染的载体 需先在同类型的体外离体培养细胞中初步验证表达特 性。 （四）基因转移 1）化学法 2）物理法 3）生物法 （五）转基因动物模型的验证 从基因组、mRNA、蛋白质和整体表型各个层次进行 验证。用核酸杂交、聚合酶链反应、免疫印迹杂交、 酶联免疫法、免疫荧光法和Western杂交法等多种方 法，筛选出有外源基因整合的阳性动物，传代后检测 外源基因在转基因动物中的表达情况，对外源基因表 达产物的生物活性和生化性质进行鉴定，以及检查转 基因动物的生理功能和是否出现某些疾病病症状的表 型等。 优点： 外源DNA大小基本不受限制（1-50kb）；导入过程直观； 整合率相对高 缺点： 设备昂贵、环节较多 对操作人员有较高的技术要求　 低效率（尤其是大家畜） 对卵子伤害大，胚胎存活率低 基因整合随机性 转基因沉默 2、胚胎干细胞（ES细胞）法 ▲ES细胞是早期胚胎的内细胞团经过体外培养建立起来的多潜能细胞系。 ▲将携带有外源基因的ES细胞注射入动物的早期胚胎内，可产生嵌合体，将来出生的动物的生殖系统就有可能整合上外源基因。通过杂交繁育得到纯合目的基因的个体，即为转基因动物。 目前，胚胎干细胞介导法在小鼠上应用比较成熟，在大动物上应用较晚。 优点： 1.外源基因整合情况的可控性高,可预先在细胞水平检测外源基因的拷贝数、定位、表达的水平及插入的稳定性　 2.外源基因导入ES细胞的方法多样，细胞鉴定及筛选方便 缺点： 1. ES细胞系建立及培养困难 2. 维持ES细胞的未分化及多向分化潜能不易，所得个体为嵌合体 优点： 受精卵携带外源基因的阳性率高 外源基因多单拷贝整合 操作简单，避免注射法对卵子的损害 宿主范围广 可同时感染大量胚胎，感染率及胚胎存活率高 4、体细胞核移植方法 ： 将外源基因导入到体细胞中，筛选、培养、扩增，用这种细胞的细胞核进行核移植，即把体细胞核植入一个去了核的卵母细胞中，融合并激活，将重构胚胎进行体外培养或者植入同步化的假孕动物的输卵管。 缺点： 技术上难度大，成功率极低， 胚胎死亡率高， 非一般实验室可以开展。 直接以精子为载体的转基因方法：将成熟精子与 外源ＤＮＡ共培养，成熟精子与外源DNA预培养之后 使精子有能力携带外源DNA进入卵子中，使之受精， 并使外源DNA整合到染色体中。 目前国际上只有1例成功模型，国内也很少有相 关报道，精子载体法很少被应用。 　 转基因动物研究出现的问题 1、制作转基因动物效率低：如显微注射法生产转基因动物小鼠、大鼠、兔、牛、猪、绵羊，转基因阳性率分别为26%、44%、15%、0.7%、0.9%,0.9%。 2、外源基因在宿主基因组中的行为难以控制：转基因随机整合于动物基因组中，有可能引起宿主细胞染色体的插入突变，可造成插入位点的基因片段的丢失及位移，也可能激活正常情况下处于关闭的基因。其结果导致转基因阳性个体出现不育、胚胎死亡、流产、畸形等异常现象。 3、转基因表达水平低：许多转基因的表达水平受到宿主染色体上整合位点的影响，出现异位表达，影响转基因的表达能力，从而使大部分转基因表达水平较低 第二节 转基因植物 转基因植物(transgenicplant)：是指利用重组DNA技术将克隆的优良目的基因导入植物细胞或组织中进行表达，从而获得新性状的植物。 这一技术使基因交流的范围无限扩大，可将从细菌、病毒、动物、远缘植物、人工合成的基因导入植物，所以其应用前景十分广阔 外源基因导入植物的方法 （1）农杆菌介导的基因转移 自然界中存在着根癌农杆菌，含有Ti质粒，约200-250kb。当农杆菌感染双子叶植物受伤组织后，Ti质粒上的一段DNA可被整合到植物的染色体上，并随染色体一起复制。农杆菌是一种天然的植物遗传转化体系 。 将表达某蛋白质的结构基因克隆到Ti质粒的T-DNA内，再用重组质粒转化农杆菌，当农杆菌感染植物细胞后，导人的外源结构基因可能整合到这些细胞的染色体上，在一定的条件下可以长成新生的植株。并将这种性状传给子代。 （2）基因枪法 利用基因枪的装置，将钨粉或金粉与外源DNA吸附制成“子弹”，通过高压放电将“子弹”加速到482m/s，金属粒