第二章基因工程酶学分解.pptVIP

本章重点 核酸限制性内切酶的类型及主要特性； 常用的DNA聚合酶的特性、用途、探针标记的原理； 常用的DNA修饰酶的用途。 5. 修饰后的T7 DNA聚合酶 （1）T7DNA聚合酶的化学修饰 去除3’?5’外切酶活性，使DNA聚合能力和聚合速率提高了3倍。 （2）修饰后的T7 DNA聚合酶的用途 ① DNA测序 双脱氧法。 ② 标记DNA 3’隐蔽末端 ③ 更有效地补平末端 6. 逆转录酶 最普遍使用的是来源于鸟类骨髓母细胞瘤病毒（avian myeloblastosis virus, AMV）： 依赖RNA的DNA聚合酶（RNA指导的DNA聚合酶）。 （1）来源 RNA肿瘤病毒。 （2）AMV逆转录酶的性质 由?和?两条多肽链组成。 ① ?链 有反转录活性和 RNaseH活性。 RNaseH： ?链经过蛋白酶水解后产生的一条多肽。 以5’?3’或3’?5’方向特异地水解RNA-DNA杂交双链中的RNA链。 RNaseH RNA DNA RNA DNA （3）逆转录酶的用途 ② ?链 RNA-DNA杂交双链中5’?3’DNA外切酶活性。 ① 合成cDNA 以oligo dT为引物（与mRNA的polyA尾巴互补结合）。 AAAAA TTTTT 5’ 3’ mRNA 5’ cDNA ② 合成cDNA探针 用随机引物（random primer）或oligo dT做引物。 随机引物：随机顺序形成的寡聚DNA 片断（8~10nt）。 （理论上能与各种序列的模板结合） ③ RT-PCR用的模板 克隆某个基因时，用其mRNA反转录出cDNA第一链。 第四节 DNA修饰酶 一、末端脱氧核苷酸转移酶 1. 来源 小牛胸腺。 2. 组成 大小两个亚基。 3. 特性 5’?3’DNA聚合酶活性 （terminal deoxynucleotidyl transferase，TdT） ② 不需要模板！ ① 需要3’—OH、二甲胂酸缓冲液。 ③ 底物可以是单链DNA、 3’—OH突出的双链DNA、 平末端在Co2+代替Mg2+下也可以。 ④ 随机添加dNTPs。 如果只有一种dNTP，就添加上同聚物。 DNA 5’ 3’ TTT dTTP ，末端转移酶 4. 末端脱氧核苷酸转移酶的用途 （1）同聚物加尾 给外源DNA片断和载体分子分别加上互补的同聚物尾巴，以使它们有效地连接。 外源DNA 载体DNA 5’ 3’ 5’ 3’ CCC CCC GGG GGG dGTP dCTP 末端转移酶 （2）再生酶切位点 便于回收克隆片断。 AAGCTT TTCGAA 5’ 5’ HindⅢ酶切 A TTCGA AGCTT A Klenow补平 AAGCT TTCGA AGCTT TCGAA AAGCTTTT TTCGA AGCTT TTTTCGAA 末端转移酶 dTTP AAA AAA 外源DNA （3）非放射性标记DNA片断的3’端 AAGCTTTT TTCGA AGCTT TTTTCGAA AAA AAA HindⅢ位点 HindⅢ位点 连接 催化非放射性标记物参入DNA片断的3’端。（生物素-1,1-dUTP等） 二、碱性磷酸酶 1. 碱性磷酸酶种类 从大肠杆菌中分离出来。 Bacterial alkaline phosphatase，BAP （1）细菌碱性磷酸酶 （2）小牛肠碱性磷酸酶 Calf intestinal alkaline phosphatase，CIP 从小牛肠中纯化出来。 具有抗热性（65℃）。 SDS中加热65oC可完全失活。 2. 碱性磷酸酶的特性 催化脱掉DNA（或RNA）5’端的磷酸根。 3’ P- -OH 5’ 3’ HO- -P 5’ 5’ 3’ HO- -OH 5’ 3’ HO- -OH 碱性磷酸酶 3. 碱性磷酸酶的用途 防止线性化的载体分子自我连接。 单一酶切口的载体的粘性末端容易自我连接。 AAGCTT TTCGAA HindⅢ酶切 A-OH TTCGA-P P-AGCTT HO-A 碱性磷酸酶 5’ 5’ 5’ A-OH TTCGA-OH HO-AGCTT HO-A OH与OH不能形成磷酸二酯键，所以不能自我连接。 但同一酶切后的外源DNA的5’端有P，能与脱磷酸的载体OH连接。 碱性磷酸酶 A TTCGA AGCTT A AGCTT A A TTCGA 连接酶 -OH与-OH连不住 其中每条链上都有一个nick，但转入细菌后会被