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实验十一 聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白质 目的 掌握聚丙烯酰胺凝胶电泳技术； 掌握同工酶遗传标记的分析方法。 原理 聚丙烯酰胺凝胶电泳简称为PAGE(Polyacrylamide gel electrophoresis)，是以聚丙烯酰胺凝胶为作为支持介质的一种常见电泳技术。聚丙烯酰胺凝胶由单体丙烯酰胺（Acr）和甲叉双丙烯酰胺聚合而成，聚合过程由自由基催化完成。催化聚合的常用方法有两种：化学聚合法和光聚合法。化学聚合法以过硫酸铵（AP）为催化剂，以四甲基乙二胺（TEMED）为加速器。在聚合过程中，TEMED催化过硫酸铵产生自由基，后者引发丙烯酰胺单体聚合，同时甲叉双丙烯酰胺与丙烯酰胺链间产生甲叉键交联，从而形成三维网状结构。 由于同工酶的酶蛋白分子的大小和结构不同，携带的电荷种类和数量不同，所以可用凝胶电泳将它们一一分开。在适宜酶催化反映的条件下提供酶作用的底物，再利用特殊的显色反应以显示产物的形成或底物的消失，就可以看到经电泳分离后的同工酶谱带。同工酶的鉴定过程通常如下： 1、从植物样品中提取粗酶液； 2、聚丙烯酰胺凝胶电泳把样品中酶带分开； 用专一作用底物和特殊染料把需要分析的酶染色，显示同工酶谱。 同工酶技术是通过电泳和组织化学方法进行特异性染色而把酶蛋白分子分离，并将其位置和活性直接在染色区带以酶谱的形式标记出来。分离同工酶的方法有：电泳法、层析法、酶学法和免疫学其中以电泳法最为普遍，电泳法中又以垂直平板聚丙烯酰胺凝胶电泳分辨率为最好。聚丙烯酰胺凝胶电泳有三种物理效应：1、样品的浓缩效应；2、凝胶的分子筛效应；3、一般的电泳分离的电荷效应。 仪器、设备、药品及材料 仪器、设备：电泳仪、电泳槽、离心机、移液管、装凝胶用的玻璃管（内径为5mm、长度为90mm）。 垂直板电泳装置图 药品：三羟甲基氨基甲烷（Tris）、四甲基乙二胺（TEMED）、丙烯酰胺（Acr）、价差双丙烯酰胺（Bir）、甘氨酸、过硫酸铵（AP）、蔗糖、溴酚蓝、联苯胺、过氧化氢。 材料：鸡爪菜（棒菜）和红苋叶片和其他植物的叶片。 内容 样品的提取 不同品种或种间的植物，取发育时期相同，组织相同的样品，制备酶粗提液。一般取样0.5g，或在恒温条件下发芽的幼苗3~5个，置于研钵中，加入0.1~0.5ml水研磨匀浆、后将样品移至小离心管中离心（3000rpm）15min，取上清液，混入等体积的50%的蔗糖溶液，电泳前可在冰箱中保存。 聚丙烯酰胺凝胶系统的配制 A液：1mol/l Hcl 48.0 ml，Tris 36.4 克 ,TEMED 0.23 ml加水至100 ml pH 8.3。 B液：丙烯酰胺 28.0克 ；甲叉双丙烯酰胺 0.735 克 加水至100 ml。 C液：过硫酸铵（用前配制）1.4 % 。 配胶：A：B：C：H2O = 1：2：0.4：4.6 配胶后立即灌好装胶的玻璃管 点击缓冲液配制 Tris 30.0克；甘氨酸14.4克加水至1000毫升、pH 8.3、使用时稀释10倍。 染色液配制——过氧化物酶染液 醋酸联苯胺溶液5毫升，3% H2O2 毫升，H2O 93 毫升。 加样和电泳 各根凝胶管加入0.05毫升的样品酶粗提液0.05毫升。加一小微滴0.005%溴酚蓝，上下电泳槽加电极缓冲液后在低于15摄氏度气温中，每管电流2mA进行电泳，当溴酚蓝迁至凝胶下端0.5-1厘米是停止电泳。电泳时间3-4小时。 用长针头注射器注水法自凝胶管中取出凝胶，凝胶要完整，不能断裂。 染色：将完整的凝胶条置于中号试管中，加入染色液，浸入整条凝胶，室温下染色20-30分钟，呈现酶带后取出凝胶，用水漂洗终止染色。 带型清楚的胶应作摄影记录或做扫描测定，胶晾干后还作永久保存。 数据记录 1、将各胶柱中酶带条数、宽度、着色深浅和移动距离填入表中。 胶柱样品 可见酶带数 由近及远记录酶带迁移距离 宽度 着色深浅 相对迁移率（主要酶带） 是否有特殊酶带 1 2 3 选择比较组分胶柱中、着色最深的酶带或特殊酶带（即该组分特有的酶带），计算酶带的相对迁移率Rf值 Rf=（某酶带迁移距离）/（溴酚蓝指示剂迁移距离） 结果讨论及分析 配制缓冲液系统对电泳的影响： 在SDS不连续电泳中，制胶缓冲液使用的是Tris-HCL缓冲系统，浓缩胶是PH6.7，分离胶PH8.9；而电泳缓冲液使用的Tris-甘氨酸缓冲系统。在浓缩胶中，其PH环境呈弱酸性，因此甘氨酸解离很少，其在电场的作用下，泳动效率低；而CL离子却很高，两者之间形成导电性较低的区带，蛋