第九章 双水相萃取课件.pptVIP

第九章 双水相萃取 基因工程产品的商业化迫切需要开发适合大规模生产的、经济简便的、快速高效的分离纯化技术。 其中双水相萃取技术(two-aqueous phase extraction,ATPS)，又称水溶液两相分配技术(Partion of two aqueous phase extraction)是近年来出现的引人注目、极有前途的新型分离技术 过滤和离心依赖于被分离颗粒的尺寸或密度的差异，当希望收集微生物的细胞器、分离去除细胞碎片、提取和浓缩胞内物质时，普通的过滤和离心技术就显得力不从心了。 溶剂萃取法难于应用于蛋白质分离。 值得注意的是溶液的分相不一定完全依赖于有机溶剂，在一定条件下，水相也可以形成两相甚至多相。于是有可能将水溶性的酶、蛋白质等生物活性物质从一个水相转移到另一水相中，从而完成分离任务。 1896年Beijerinck观察到当把明胶与琼脂或把明胶和可溶性淀粉的水溶液混合时，先得到一混浊不透明的溶液，随后分成两相，上相含有大部分明胶，下相含有大部分琼脂(或可溶性淀粉)。 再如下图中，2.2％的葡聚糖水溶液与等体积的0.72％甲基纤维素钠的水溶液相混合并静置后，可得到两个粘稠的液层。 聚合物的不相溶性主要是由于聚合物分子的空间阻碍作用，相互间无法渗透，当聚合物的浓度达到一定值时，就不能形成单一的水相，所以具有强烈的相分离倾向。 某些聚合物的溶液与某些无机盐的溶液相混合时，只要浓度达到一定值，也会形成两相，即聚合物-盐双水相体系，成相机理尚不清楚，一种解释为“盐析”作用。 双水相萃取法的特点是能够保留产物的活性，整个操作可以连续化，在除去细胞或细胞碎片时，还可以纯化蛋白质2～5倍，与传统的过滤法和离心法去除细胞碎片相比，无论在收率上还是成本上都要优越得多。 定义 利用物质在互不相溶的两水相分配系数的差异进行分离纯化的过程 可形成双水相的双聚合物体系很多，如聚乙二醇(polyethylene glycol,略作PEG)/葡聚糖(dextran，略作Dx)，聚丙二醇(polypropylene glycol) / 聚乙二醇和甲基纤维素(methylcellulose)/葡聚糖等。双水相萃取中常采用的双聚合物系统为PEG/Dx，该双水相的上相富含PEG，下相富含Dx。除双聚合物系统外，聚合物与无机盐的混合溶液也可形成双水相，例如，PEG/磷酸钾(略作KPi)、PEG/磷酸铵、PEG/硫酸钠等常用于生物产物的双水相萃取。PEG/无机盐系统的上相富含PEG，下相富含无机盐。 9.2双水相系统的形成及种类 1）双水相体系的形成——高聚物分子间的作用力 作用力为斥力：形成双水相体系 作用力为引力：形成两相，其中一相为两高 聚物相，一相为水相 作用力没有强烈的引力或斥力：完全互溶，形成均一相 2）可以构成双水相的体系： 离子型高聚物－非离子型高聚物 PEG－DEXTRAN 高聚物－相对低分子量化合物 PEG－硫酸铵 然而，这些参数并不是独立地起作用。所以要预测溶质在双水相系统间的分配系数是困难的。这些系统复杂性表现在如下的一些例子中：在一相中引入疏水性基团会影响离子的分配和电位，在大分子(亲水聚合物或蛋白质溶质)结构中构象的变化，能使另一些原子暴露在微环境中。这些事实导致只能用实验的方法来确定满足分配要求的操作条件。 9.3.1 双水相中聚合物组成的影响 双水相系统作为一种成功的萃取方法，很大程度上取决于使用的聚合物类型，当两种不同聚合物的溶液混合时，可能存在三种情况： a 完全混溶性(匀相溶液)； b 物理的不相溶性(相分离)； c 复杂的凝聚(相分离,聚合物聚集在同一相中，纯溶剂-水聚集在另一相中)。 离子和非离子聚合物都可以使用在双水相系统的构成上，但是，当这两种聚合物是离子化合物并带有相反电荷时，它们互相吸引并发生复杂的凝聚。 例如，PEG/KPi系统中上、下相(或称轻重相)的PEG和磷酸钾浓度以及Cl离子在上、下相中的分配平衡随添加NaCl浓度的增大而改变。这种相组成即相性质的改变直接影响蛋白质的分配系数。离子强度对不同蛋白质的影响程度不同，利用这一特点，通过调节双水相系统中的盐浓度，可有效地萃取分离不同的蛋白质。 9.4双水相萃取工艺流程 9.5双水相萃取的优点 平衡时间短、含水量高、截面张力小，特别适合于生物活性物质的分离纯化 操作简便 易于放大 * * 基因工程产品如蛋白质和酶往往是胞内产品，需经细胞破碎后才能提取、纯化，细胞颗粒尺寸的变化给固－液分离带来了困难，同时这类产品的活性和功能对pH值、温度和离子强度等环境因素特别敏感。由于它们在有机溶剂中的溶解度低并且会变性，