MAPK1和eEF1B对奶牛乳腺上皮细胞泌乳调控的作用及机理研究报告.docVIP

MAPK1和eEF1B对奶牛乳腺上皮细胞泌乳调控的作用及机理研究报告 　　摘 要：该研究采用组织块儿培养法，成功构建了体外培养的奶牛乳腺上皮细胞模型，应用CASY细胞分析仪检测了不同浓度和作用时间下蛋氨酸和赖氨酸对奶牛乳腺上皮细胞活力的影响，利用高效液相色谱检测了β-casein的分泌情况，确定了蛋氨酸和赖氨酸最佳剂量分别为0.6 mmol/L和1.2 mmol/L，最佳作用时间为24 h。建立奶牛乳腺上皮细胞核磷酸化蛋白质组技术，应用双向电泳（2-DE）结合质谱技术（MALDI-TOF-MS）鉴定蛋氨酸和赖氨酸对奶牛乳腺上皮细胞核磷酸化蛋白质的差异影响，发现蛋氨酸处理组，mitogen-activated protein kinase 1（MAPK1）和eEF1B蛋白质表达上调；并应用荧光定量PCR和Western blotting技术验证差异蛋白在转录水平和蛋白水平上的表达，与2-DE结果一致。实验过程中构建了真核表达载体pGCMV-IRES-EGFP-MAPK1、eEF1B，转染至奶牛乳腺上皮细胞中，通过G418筛选获得稳定转染的细胞株；然后通过基因沉寂和过表达等技术，减少或增加MAPK1、eEF1B的表达水平后，检测泌乳信号转导通路中重要调控蛋白的表达情况，发现蛋氨酸和赖氨酸营养素可以通过调节MAPK1、eEF1B介导mTOR信号转导通路，影响Stat5的表达，进而调