代谢设计育种的实践范例.ppt

2001年春 2002年春 张星元：代谢设计育种 张星元：发酵原理（讲座） 第9章 微生物代谢设计育种的实践 主讲 惠 明 博士 一、微生物育种的发展阶段 微生物纯培养技术的建立（巴斯德、科赫等） 自然选育纯系良种（最初的酒精发酵） 人工诱变随机挑选（抗生素生产） 杂交育种 代谢控制育种（或代谢设计育种或推理育种）——采用人工诱变定向选育 基因工程育种 三、 育种方案的设计 1 初发菌株的选定2 遗传操作方案的制定3 遗传操作方案的实施 4 突变株的获得 5 突变株培养条件的优化 6 中试及组织生产 2 遗传操作方案的制定 物理诱变 化学诱变 复合诱变 定向诱变 插入基因拷贝 插入途径基因组 3 遗传操作方案的实施 缺陷型突变株的获得 结构类似物抗性突变株的获得 结构类似物超敏性突变株的获得 分子生物学方法（略） 4 高产突变株的筛选 营养缺陷型突变株 酶缺损突变株 输送体系缺损突变株（载体合成缺陷） 条件突变株（如温度敏感型突变株） 5 突变株培养条件的优化 单因素试验 多因素试验 回归试验 补料试验 连续发酵 6 中试及规模发酵生产 中试 规模发酵生产 设计原理 方法 实际应用 设计原理 VH营养缺陷型突变株的筛选方法 2、案例分析——核黄素发酵中2-DGR突变株的选育 设计原理：Glc的输送（基团转移） 方法：结构类似物抗性平板法 效果 实验方法 案例二：核黄素发酵中TubR突变株的筛选 设计原理：解除反馈抑制或反馈阻遏 方法：结构类似物抗性 效果 用阿舒假囊酵母生产核黄素 案例分析：庆大霉素C1a发酵中FOMss突变株的筛选 设计原理 方法 实效性 G+与G-细菌的细胞外层结构 实验方法 反馈调节突变株：抗性 输送体系突变株：抗性 对入围的突变株进行复筛 进行产量形状的筛选，确定高产菌株 突变株的检出及确定 尽量从生物统计学的角度安排试验 尽量排除培养基消毒、摇瓶培养条件不一致带来的系统误差 每批摇瓶试验都要做对照 注重产量与菌体量之间的的微妙关系（生物机器的特殊性） 高产株培养条件的优化 2-DG形成的抑制菌圈 (60Co γ射线，600~800Gy) G-6-P R-5-P PRPP VB2 ATP AMP Eremothecium ashbyii RIBOFLAVIN （三）结构类似物超敏性突变株的筛选 什么是结构类似物超敏性突变株？ 这种对结构类似物的超敏性，是与生长有密切关系的酶的欠损突变的表征。一般这些酶位于中心代谢途径上，对底物的结构类似物表现出超敏性。有可能从酶的底物的结构类似物的超敏性突变株中，找到这种酶的低水平突变株。酶水平低，代谢流的通道就窄，就意味着“节”（节流）。 如：F-PYR是PYR的结构类似物，F-PYRSS突变株，常常是PD酶欠损或损伤突变株，这样由PYR往AcCoA代谢的路径不畅通，从而可能使PYR能够过量合成。 设计原理 * * 2001年春 《现代微生物学》 一、微生物育种的发展阶段 二、代谢设计育种的启动步骤 三、育种方案的制定 四、代谢设计育种的实施 本节内容 二、 代谢设计育种的启动步骤 什么是代谢设计育种？ 以工业发酵的基本原理为依据，采用不定向诱变、机理性定向筛选的方法或遗传工程的手段对菌种进行有计划的、遗传目标比较明确的遗传改造，为代谢流尽可能流向目的产物添加遗传依据。这样的育种方法称为代谢设计育种(Metabolic Designed Breeding) 1 目的产物代谢途径的组合（五段式）2 中心代谢流上节点的分析3 理想载流途径的推定 4 五字策略的应用 代谢设计育种的策划 1 目的产物代谢途径的组合（五段式） 目的产物合成代谢的“五段式”  代谢网络上的交叉点（代谢中间化合物）叫做代谢网络的节点。节点有刚性和挠性之分。挠性节点处的流量分配容易发生改变，任何分支可以得到 100% 的流量。刚性或弱刚性节点的流量分配比例不容易发生改变。 （挠度：构件受到外力时发生弯曲变形的程度） 2 中心代谢流上节点的分析 S S P1 P1 P2 P2 P1 I P1 I P2 I P2 I P1 A P2 A 强刚性节点 弱刚性节点 优 网络刚性是自然选择的结果，是细胞经济体系的保障作用的体现。刚性节点是由反馈调节和交叉激活等代谢自动调节机制来支持的，解除调节可望改变节点的性质。然而，代谢自动调节机制不但包括反馈调节和交叉激活。刚性节点的支持背景尚未