琼脂糖凝胶天然琼脂.pptVIP

凝胶电泳 凝胶电泳：由琼脂、琼脂糖、淀粉胶及聚丙烯酰胺等物质作支持体的电泳。 特点： 1. 可以制成非常均匀的凝胶，带电质点在凝胶的孔中泳动。 2. 操作方法简便，电泳速度快。 3. 分辨率高，重复性好，电泳图谱清晰。 4. 适用于生化、免疫等定性定量测定。 琼脂糖凝胶电泳 琼脂糖凝胶电泳是分离鉴定和纯化DNA片段的标准方法。 该技术操作简便快速，可以分辨用其它方法（如密度梯度离心法）所无法分离的DNA片段。 当用低浓度的荧光嵌入染料溴化乙啶(Ethidium bromide, EB)染色,在紫外光下至少可以检出1-10ng的DNA条带,从而可以确定DNA片段在凝胶中的位置。 此外,还可以从电泳后的凝胶中回收特定的DNA条带,用于以后的克隆操作。 琼脂糖 琼脂糖是由琼脂中提取出来的，D-半乳糖和3、6-脱水-L-半乳糖结合的链状多糖。 中性物质，不带电荷 琼脂糖凝胶的优点 (1) 操作简单，电泳速度快，样品不需事先处理就可进行电泳。 (2)琼脂糖凝胶结构均匀，对样品吸附极微，因此电泳图谱清晰，分辨率高，重复性好。 (3)琼脂糖透明无紫外吸收，电泳过程和结果可直接用紫外监测及定量分析。 (4)电泳后区带易染色，样品易洗脱，便于定量测定。制成干膜可长期保存。 缺点： 1.机械强度差，易破碎，浓度不能太低。 2.易被细菌污染，不易保存，临用前配制。 3.琼脂糖支持层上的区带易于扩散，电泳后必须立即固定染色。 4.与PAGE相比，分子筛作用小，区带少。 影响琼脂糖凝胶电泳的因素 DNA分子的大小：实验证明，DNA片段迁移距离与其分子量的对数成反比； 琼脂糖的浓度：一定大小的DNA片段在不同浓度的琼脂凝胶中，电泳迁移率不相同； DNA分子的构型：不同构型的DNA在琼脂糖凝胶中的电泳速度差别较大。 琼脂糖凝胶浓度与可分辨的DNA大小范围的关系 核酸构型与琼脂糖凝胶电泳分离的关系 在分子量相当的情况下，不同构型的DNA的移动速度次序如下： 共价闭环DNA (covalently closed circular，简称cccDNA)＞直线DNA＞开环的双链环状DNA。 质粒 同一种质粒，由于其构象不同，电泳时的迁移率也不同。 常会出现两条或三条电泳带 一条是超螺旋质粒DNA的带，移动速度最快； 另一条是（松弛）螺旋状质粒DNA带（开环质粒DNA），移动速度最慢。 有时因为有一些质粒DNA在提取过程中遭到损伤而线性化（线状质粒DNA），其移动速度介于螺旋状和超螺旋状质粒DNA之间。 电泳缓冲液 常用三种缓冲液 Tris-硼酸（TBE） Tris-乙酸（TAE） Tris-磷酸（TPE） Tris（三羟甲基氨基甲烷）：是一种生物碱，常用于生物实验中配制各种pH值的缓冲液。1M的Tris溶液的pH值大约是10～11。 EDTA 可螯合二价阳离子，抑制DNA酶的活性，防止DNA降解。 TBE与TPE：缓冲容量高，DNA分离效果好，但TPE在DNA片段回收时含磷酸盐浓度高，容易使DNA沉淀， TAE：缓冲容量低，但价格较便宜。 EDTA 乙二胺四乙酸（ethylenediaminetetraacetic acid），是一种有机化合物。它是一个六齿配体，可以螯合多种金属离子。抑制DNA酶的活性，防止DNA降解。 由于EDTA在水及酸中的溶解度很小，常用的为其二钠盐，也简写为EDTA 。 10×TBE缓冲液的配制 配方 Tris 108克 EDTA 9.3克 硼酸 55克 H2O至 1000ml pH应为8.0～8.2 临用时用水稀至1×TBE（10倍稀释） 上样缓冲液 0.25％溴酚兰；0.25％二甲苯青；30％甘油水溶液 作用： ①增加样品密度，使其比重增加，以确保DNA均匀沉入加样孔内 ②在电泳中形成肉眼可见的指示带，可预测核酸电泳的速度和位置 ③使样品呈色，使加样操作更方便 核酸电泳的染色剂 溴化乙锭（ethidium bromide，EB） 是一种荧光染料，EB分子可嵌入核酸双链的碱基对之间，在紫外线激发下，发出桔红色荧光 可在凝胶电泳液中加入终浓度为0.5ug/ml的EB，有时亦可在电泳后，将凝胶浸入该浓度的溶液中染色10～15min EB染料有许多优点，如染色操作简便、快速，灵敏度高，10ng或更少的DNA即可检出。 银染色 银染色液中的银离子(Ag+)可与核酸形成稳定的复合物，然后用还原剂如甲醛使Ag+还原成银颗粒，可把核酸电泳带染成黑褐色。 主要用于聚丙烯酰胺凝胶电泳染色，也用于琼脂糖凝胶染色。 灵敏度比EB高200倍，但银染色后，DNA不宜回收 聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE） 聚丙烯酰胺凝胶是由单体丙烯酰胺(acrylamide，Acr)和交联剂N，N-甲叉双丙烯酰胺(methylene-bisacryla