分子生物学技术进展与其在生物医学研究中的应用.pptVIP

现代分子生物学技术进展与其在生物医学研究中的应用 主要内容 我对生命科学以及医学科研的理解 分子生物学在医学科研中的地位和作用 分子生物学及其技术的基本理论 分子生物学基本技术简介 现代分子生物学研究技术进展 生命科学研究内容 生命和生命有机体 生命运动的本质和规律 生命活动的主要特征：活的 代谢、生长、发育、繁殖、遗传、变异、进化等 遗传信息传递的各个环节 医学研究与实践 生物医学科研层次 CGAATATTCG双链DNA 基因概念 中心法则的延伸意义 基因结构与表达决定了疾病 DNA的性质与利用 核酸分子杂交与分子识别 特异性: 基础 可观察性: 目标 DNA的复制与转录 特点：半保留，精确 子代分子含有一条母链和一条新合成的新链；子代分子与亲代分子结构完全相同。 条件：DNA聚合酶，引物，原料（dNTPs），温度，缓冲液 分子生物学基本技术 核酸蛋白质提取纯化技术 分子杂交技术 DNA体外和体内扩增技术 核酸凝胶电泳技术 突变分析 RFLP，SSCP，DGGE，SEQ 核酸提取技术 要求：去除杂蛋白、多糖、脂类等大分子杂质，同时要快速简便。 常用的提取方法： 酚-氯仿提取法 盐析法 高温裂解法 固相吸附洗脱法 碘化钠提取法 ? DNA(RNA)体外合成与扩增技术 聚合酶链反应技术PCR 连接酶链反应技术LCR 体外转录技术 逆转录技术 新技术进展 基因芯片技术 液相基因芯片技术 原位杂交技术 光谱核型分析技术 实时荧光定量PCR技术 基因芯片技术 液相基因芯片技术 用液态芯片来检测蛋白 液态芯片在蛋白水平上检测的疾病 荧光原位杂交 PCR技术 模仿体内DNA复制, 反复热循环, DNA产量呈指数增加。 三步曲： 变性：DNA模板被加热至94°C，此时双链DNA被分解成两条单链DNA。 复性：两条特定的寡核苷酸引物分别和两条单链DNA的端口复性 延伸：复性后的DNA片段，在聚合酶的作用下延伸。 marker 染色体的产前诊断（1） 聚合酶链式反应（PCR）技术 1985年，美国 Mullis等人发明聚合酶链反应(PCR)，原理类似于DNA的体内复制。 PCR技术是生命科学领域最重要的成果之一，于1993年获得诺贝尔奖。 PCR技术与常规核酸检测技术的区别 标本要求低 实验所需时间短 敏感性高 操作简单 普通PCR技术的局限性 易污染 不能定量检测 特异性不能得到保证 人为因素影响明显 荧光定量PCR仪 荧光定量PCR是PCR的一种。 美国ABI公司1996年推出荧光定量PCR仪。 现在主要有ABI、Roche、Bio-Rad和MJ 荧光定量PCR仪。 荧光定量PCR的优点 定量准确 特异性强，克服了假阳性问题 操作快速，免去PCR后处理 安全，对操作员和环境都无危害 自动化程度高 荧光定量PCR的优点 常规PCR与荧光定量PCR比较 荧光报告基团（R）被Taq酶切断，游离R的荧光不能被Q淬灭，荧光被检测到。 荧光报告基团（R）产生的荧光信号可代表PCR产物的量。 不同模板扩增动力曲线 标准品动力曲线 荧光定量PCR的应用 临床诊断治疗 肿瘤研究 基因表达研究 基因突变及多态性的研究 基因分析的定量化是未来基因诊断的发展趋势。 使极微量的基因表达或DNA拷贝数定量成为可能。 荧光定量技术在整个生命科学领域的应用与普及特别是临床诊断领域的推广。 成为未来分子生物学实验室必备的研究工具。 生物医学研究的分子生物学其它新技术 RNA干扰技术 转基因和基因转染技术 基因敲除技术 全基因组扫描技术 蛋白双向电泳技术 毛细管测序技术 谢谢 THANKS THANKS 荧光PCR重现性 展 望 在不同颜色的乳胶颗粒上可以共价地结合上抗体（如图）或抗原。病人血清中的蛋白（抗原）或抗体回与乳胶颗粒上的反应物特意性地结合并加上标记。最后通过激光就可以判断是否有相关疾病了。 双抗体夹心 双抗原夹心 标记抗原竞争法 自身免疫疾病 肿瘤筛查 各种感染性疾病的免疫学检测 过敏源识别 激素测定 免疫蛋白分类 酶水平的测定 血清蛋白图谱 原位杂交 卵泡组织VEGF-Mrna 100X SkyPaint 探针用五种不同的荧光染料进行了探针标记: FITC, Rhodamin, TexasRed, Cy5 和 Cy5.5. 光谱核型分析技术SKY chr chr chr Label Label Label 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 X Y BCD E ACDE CD ABDE BCDE BC D ADE CE ACD BE AD B ABC BD C ABD AC A