基于基于抗原抗体反应的检测方法（参考）.pptVIP

免疫学检测原理 第一节 基于抗原-抗体反应 的检测方法 学习目的 ： 一、掌握抗原-抗体结合反应的特点 二、了解影响抗原-抗体反应的因素 三、学习抗原-抗体反应的基本检测方法 抗原-抗体反应： 指抗原与相应抗体在体内或体外发生的特异性结合反应。 主要应用： 用已知抗原检测未知抗体 用已知抗体检测未知抗原 定性或定量检测体内各种大分子 物质 用已知抗体检测某些药物、激素和 炎性介质等各种半抗原物质 一、抗原-抗体结合反应的特点 高度特异性 定义：一种抗原通常仅能与由它刺激所产生的抗体 结合。 分子基础：抗原表位与抗体的抗原结合部位间存在 分子结构的互补性，二者可特异性结合。 交叉反应 共同抗原决定基刺激机体产生的抗 体分别与两种抗原 ( 共同抗原 ) 结合发 生反应。 机理：具有相同的抗原表位 抗原-抗体结合的带现象与可见性 前带现象：抗体过剩 后带现象：抗原过剩 网格复合体：抗原、抗体的数量比例合适。 反应体系基本不存在游离的抗原或抗体，形成肉眼可见 的反应物（沉淀物或凝集物）。 可逆性 抗原-抗体反应为分子表面的非共价键结合，结合虽稳定但可逆。 过剩方结合价未被完全占据，成游离小分子复合物或解离，不可见 二、抗原-抗体反应的影响因素 内因：1）抗体的特异性和亲和力 2）抗原理化性质、抗原表位多寡和种类 3）抗原抗体的浓度、比例 （影响最大，决定因素） 外因：1）电解质 使抗原-抗体复合物失 去电荷而凝集，出现可见反应 2）酸碱度 最适pH6～8 3）温度 适宜（可增加抗原 与抗体的碰撞机会，加快结合速度） 三、抗原-抗体反应的基本检测方法 凝集反应：细菌或红细胞等颗粒性抗原与相应抗体直接反应出现凝集。 沉淀反应：可溶性抗原与相应抗体结合后， 在一定条件下出现肉眼可见的沉淀。 补体参与的反应：应用抗体与红细胞表面抗 原结合，激活反应体系中的补体成分， 根据溶血现象判定试验结果。 免疫标记技术：用荧光素、酶、 放射性核素或化学发光物质等标 记抗体或抗原，进行抗原-抗体 反应的检测. 单向免疫扩散： 特点：定性半定量 用途：可用于测定血清IgG IgM IgA 和C3等的含量 原理：沉淀环的直径与抗原含量呈正相关 操作： 铺板 ↓ 打孔 ↓ 加样 ↓ 放湿盒 ↓ 看结果 双向免疫扩散 用途：鉴定两种抗原是否相同 特点：定性半定量 操作： 铺板 ↓ 打孔 ↓ 加样 ↓ 放湿盒 ↓ 看结果 免疫电泳 常用于血清蛋白的组分分析 在一定量的抗体中，分别加入递增量的抗原，经一定时间后形成抗原抗体复合物，用浊度计测量反应液体的浊度，并与一系列标准品对照，由此推算样品中的抗原含量。 免疫比浊 原理：抗体浓度（高浓度）固定时，形成的免疫复合物的量随着检样中抗原量的增加而增加，反应液的浊度也随之增加。 免疫标记技术： （1）免疫荧光法 （2）酶免疫测定 （3）放射免疫测定法 （4）化学发光免疫分析 （5）免疫印迹法 （1）免疫荧光法 优点:特异性高 缺点:检查任一抗原均须制备相应荧光抗体。 间接荧光法 优点:敏感度比直接法高，制备一种荧光素标记的二 抗即可用于多种抗原的检测。 缺点：非特异性反应亦增强。 直接荧光法 荧光素与抗体连接，再与抗原反应（对抗原定性或定位） （2）酶免疫测定 将抗原-抗体反应的特异性与酶催化作用的高效 性相结合，借助酶作用于底物的显色反应判定结果。 酶联免疫吸附试验(ELISA)：测定可溶性抗原或抗体。 免疫组化技术：应用标记的抗体与组织或细胞抗原发生反应，结合形态学观察，对组织或细胞表面抗原进行定性、定量、定位。 双抗体夹心法 间接法 酶联免疫斑点实验 ELISPOT BAS-ELISA（生物素-亲和素系统） 双抗体夹心法：用于检测特异性抗原。 操作步骤： 用已知抗体包板→ 洗涤→ 封板→ 洗涤→ 加入待检标本→ 洗涤→ 加酶标抗体→ 洗涤→ 加底物显色→ 结果观察 间接法：用于检测特异性抗体。 基本步骤：用已知抗原包板→洗涤→加入待检抗体→洗涤→加酶标二抗→洗涤→加底物显色→观察结果