00生物化学实验--常用生物化学实验技术及原理-层析技术.docVIP

层析技术 　　层析法又称色谱法或色层法，开始由分离植物色素而得名，后来不仅用于分离有色物质，而且在多数情况是用于分离无色物质。层析法是近代生物化学最常用的分析方法之一，此种方法可以分离和鉴定性质极为相似，而且用一般化学方法难以分离的多种化合物，如氨基酸、蛋白质、糖、脂类、核苷酸、核酸等。 一、层析的基本原理 　　层析法是利用混合物各组分物理化学性质（溶解度、吸附能力、电荷、分子大小与形状及分子亲和力等）的差别，使各组分以不同程度分布在两相中，其中一相为固定相，另一相即流过此固定相的液体或气体称流动相，从而使各组分以不同的速度随流动相向前移动而达到分离的目的。 　　在层析过程中，溶质在固定相和流动相中差速迁移，它既可进入固定相，又可进入流动相，这个过程叫分配过程，不论层析机理属于哪一种，分配过程都存在。分配过程进行的速度，可用分配系数 K 表示： 　K ＝ 　　比值 K 在低浓度时是个常数，只受温度影响。不同的层析机理， K 的含义不同。在吸附层析中， K 为吸附平衡常数；在分配层析中， K 为分配系数；在离子交换层析中， K 为交换常数；在亲和层析中， K 为亲和系数。 　　混合物中各组分的分配系数往往是不同的，即保留在固定相中的特性是不同的。常用保留时间，即被分析样品从进样开始到流出液中出现浓度极大点的时间；或保留体积，即被分析样品从进样开始到流出液中出现浓度极大点时，所通过流动相的体积来衡量。　　分配系数 K 值大，说明该物质在柱中被吸附得牢，移动速度慢，在固定相中停留的时间长，将最后出现在洗脱液中亦既保留体积大，保留时间长。反之，如 K 值小，即这种物质在柱中被吸附得弱，移动速度快，将首先出现在洗脱液中。亦既保留体积小，保留时间短。可见混合物中各组分之间分配系数 K 值相差愈大，各物质愈容易彼此分开。如果 K ＝ 0, 就意味这溶质不能进入固定相，而始终保留在流动相里，并随着流动相迅速的流出。显然，这种固定相和流动相体系是不能实现分离的。因此，应当根据被分离物质的化学结构和性质（极性）适当的选择固定相和流动相，并且使各组分的分配系数尽可能大一些，就可以使混合物中各组分分离完全。 二、层析的分类 （一）按层析两相所处的状态分类 　　流动相有液体和气体两种状态。液体作为流动相，称为液相层析；气体作为流动相，称为气相层析。固定相有液体和固体两种状态，即以固体吸附剂作为固定相和以附载在固体上的液体作为固定相。所以，层析法按两相所处的状态可以分为： 　　1 ．液相层析 （ 1 ）液 — 固层析 液体作为流动相，固体吸附剂作为固定相。 （ 2 ）液 — 液层析 液体作为流动相，附载在固体上的液体作为固定相。　　 2 ．气相层析 （ 1 ）气 — 固层析 气体作为流动相，固体吸附剂作为固定相。 （ 2 ）气 — 液层析 气体作为流动相，附载在固体上的液体作为固定相。 （二）按层析过程的机制分类 　　1 ．分配层析 　　利用不同组分在流动相和固定相之间的分配系数（或溶解度）不同，而使之分离的技术。 　　2 ．吸附层析 　　利用不同组分被吸附剂表面吸附性能的差异，而使之分离的技术。 　　3 ．离子交换层析 　　利用不同组分对离子交换剂亲和力的不同，而进行分离的技术。 　　4 ．凝胶层析 　　利用某些凝胶对不同组分因其分子大小不同而阻滞作用不同的差异，而进行分离的技术。 　　5 ．亲和层析 　　利用某些生物高分子能与相应的配体专一可逆结合的机理，而进行分离纯化高分子的技术。 （三）按层析装置分类 　　1 ．柱层析 　　将固定相装于柱内，使样品沿一个方向移动而使之各组分达到分离。 　　2 ．纸层析 　　用滤纸作液体的载体，附载在滤纸上的 H 2 O 作固定相，有机溶剂作流动相。点样后，用流动相展开，使样品中各组分分离。 　　3 ．薄层层析 　　将适当程度的吸附剂涂铺成薄层，以纸层析类似的方法进行物质的分离。 三、常用的层析技术 　（一）分配层析 　　分配层析是利用混合物中各组分在两相中分配系数不同而使之分离的层析技术。相当于一种连续性的溶剂抽提方法。如用带水的原料（载体）作为一种液相（固定相），加入与水不与混合或仅部分混合的溶剂为另一种液相（流动相），由于混合物各组分在两相中发生不同的分配而逐渐分开，形成层析谱。载体在分配层析中只起负载固定相的作用，它们是一些吸附力小、反应性弱的惰性物质如淀粉、纤维素粉、滤纸等。固定相除水外，也可用稀硫酸、甲醇、仲酰胺等强极性溶液，流动相则采用比固定相极性小或非极性的有机溶剂。　 纸层析是最广泛应用的一种分配层析，以滤纸为载体，滤纸上吸附着的水（约含 20 ％～ 22 ％），是经常使用的固定相。某些有机溶剂如醇、酚为常用的流动相。