第3章光谱分析技术.ppt

第五章 常用生物化学检验技术 第一节 光谱分析技术 第二节 电化学分析 第三节 电泳技术 第四节 层析技术 第五节 自动生化分析 技术 本章小结 3.离子强度 是指溶液中各种离子的摩尔浓度（Ci）与其电荷数平方（Zi 2）乘积总和的1/2。即 　 I=1/2∑CiZi 2 I的单位是mol/L。 如0.1mol/L NaCL I=0.1mol/L 0.2mol/LMgCL2 I=0.6mol/L 对于缓冲液I计算，由于弱酸的电离度很低，一般只计算盐的。 I愈大，缓冲能力越大，pH越稳定，但缓冲液所载分电流增加，样品所栽的电流减少，电泳速度减慢，导电能力增加，产热增加。 I过小，缓冲能力小，pH不稳定，缓冲液所载分电流减少，样品所载分电流增加，缓冲液粘度系数降低，电泳速度加快。但样品在支持物上扩散严重，分辨率降低。 兼顾两方面的影响，一般在0.05~0.1 mol/L。 （二）支持介质 对支持介质的基本要求是具有化学惰性，不与被分离的样品或缓冲液起化学反应，并具有一定的坚韧度。 1.吸附 使被分离样品滞留，而降低电泳速度，造成拖尾而使分辨率降低。 2.电渗 电泳过程中液体对固体支持物的相对移动称为电渗。 实际上是电泳材料表面的电荷引起水的定向移动。 当电渗作用方向与电泳方向一致，电泳速度加快，顺水行舟。 当电渗作用方向与电泳方向相反，电泳速度减慢，逆水行舟。 四、常用电泳技术 区带电泳是目前应用最广泛的一种电泳技术，区带电泳的支持介质常用的有滤纸，醋酸纤维薄膜，凝胶等。 （一） 滤纸电泳（PE） 是应用最早的支持介质。优点：材料价廉易得，有一定机械强度。缺点：电泳时间长，8～10h，吸附作用大，造成拖尾而降低了分辨率，目前已淘汰。 （二） 醋酸纤维薄膜电泳（CAE） 1957年Kohn首先采用，醋酸纤维素是将纤维素分子中葡萄糖单体上的羟基乙酰化而形成纤维素醋酸酯，然后用丙酮和水的混合溶剂溶解，涂成均匀薄膜。 优点：对蛋白质吸附作用很小，分辨率高，区带清晰，不吸附燃料，区带周围燃料可完全清掉，检测灵敏度较高，样品用量少0.3~2μl，电泳时间短20min~1小时，可透明，便于用光密度扫描仪定量。 缺点：有轻度电渗作用，吸水性较差，较脆。 （三）琼脂糖凝胶电泳（AGE） 琼脂糖是从琼脂中分离得到的一种多糖。主要由半乳糖和L-3，6-脱水半乳糖构成。常用浓度0.5~1.0% 。 优点：吸附作用，电渗作用很小，故分辨率重现性好，应用广，同工酶，脂蛋白，免疫电泳，样品用量少0.6~3.0μl，电泳时间短30min~1h。透明度好，电泳后可直接扫描定量，也可烘干制成薄膜。 缺点：电泳完毕后区带易扩散，可及时固定。点样方法，挖孔法，滤纸插入法。 （四） 聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE） 是一种人工合成的高分子材料，60年代新用于电泳分析，能将血清蛋白分为20多种组成。 优点： 1.具有分子筛作用，分离效果好。 2.化学稳定性高，是一种稳定的亲水胶体。 3.几乎没有吸附和电渗作用。 4.机械强度好，无色透明，可直接光密度扫描。 5.可调节凝胶孔径以适合不同分子量的分离。 1. 聚合 丙烯酰胺＋甲叉丙烯酰胺 聚丙烯酰胺 （Acr）单体 （Bis）交联剂 化学摧化 过硫酸铵-TEMED（四甲基乙二胺）系统 加速剂TEMED促使引发剂过硫酸铵形成自由基，自由基与Acr接能，使Acr单体形成自由基而活化，从而引发聚合，聚合速度与pH，单体浓度，温度有关。 催化系统 引发剂 加速剂 光催化 核黄素-TEMED系统，核黄素经光照被还原成无色核黄素，在和痕量氧的条件下，无色核黄素又被氧化成核黄素自由基，使Acr活化，从而引发聚合。 优点：核黄素用量少（10mg/L），对样品分析无影响，聚合时间可通过调节光照时间，强