代谢物酶法分析技术演示文件修改版.ppt

酶活性恢复法应用举例 丙酮酸激酶法或色氨酸酶法测定钾离子 α-半乳糖苷酶法测定钠离子 淀粉酶法测定氯离子 超氧化物歧化酶法测定铜离子 碳酸酐酶或碱性磷酸酶法测定锌离子等 激活和抑制法 有机磷是乙酰胆碱酯酶的抑制剂，用标准乙酰胆碱酯酶与标本在37℃水浴10min，测定剩余的乙酰胆碱酯酶的活性，被抑制的乙酰胆碱酯酶的活性可以计算出标本中有机磷的含量。 有机磷的酶法测定 根据酶有否激活剂和抑制剂存在时酶促反应动力学发生改变来测定激活剂和抑制剂的含量。 另有抑制ALP法测定茶碱、激活HK法测定镁离子等。 返回章目录 试剂酶质量 试剂酶概念 试剂酶特征 试剂酶纯度 酶法设计要求 酶法设计共性要求 平衡法设计的要求 速率法设计的要求 代谢物酶法分析的设计要求 3 试剂酶来源 试剂酶是指作为诊断试剂来测定化合物浓度或酶活性的一类酶。它是酶试剂的核心，它的质量是酶试剂质量的决定性因素。 试剂酶的质量要求 (1) 试剂酶的概念 主要来自动植物组织提取及微生物发酵工程。基因重组酶蛋白也有应用，活力高，杂酶含量少且价格低廉。 不同来源的同一种试剂酶有不同的理化特征。必须掌握专一性和分子量、等电点、Km、最适pH，最适温度等，并熟悉辅助因子、激活剂和抑制剂对酶活性的影响。 试剂酶的来源和理化特征 试剂酶的质量要求 (1) 不同的酶试剂系统对试剂酶的纯度有不同的要求。以NAD(P)H为指示反应中，要求试剂酶有较高的纯度。而在Trinder反应中要求相对低一些。 纯度主要指标 ①酶的比活性，酶的比活性越高，酶的纯度越高。②杂酶含量，容易引起副反应的一些酶含量按 “允许限度”的要求（见表5-2）。 试剂酶的质量要求 (1) 试剂酶的纯度要求 表5-2常用试剂酶的理化特征及质量要求 不含胺氧化酶及过氧化氢酶 ＞50 7.20 40200 辣根 过氧化物酶(POD) 己糖激酶、磷酸葡萄糖异构酶＜0.02% ＞140 4.50 212000 酵母 葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(G-6-PDH) 磷酸葡萄糖异构酶＜0.01%,G-6-P脱氢酶＜0.01% ＞140 4.50-4.80 105000 酵母 己糖激酶(HK) 蔗糖酶含量＜0.01%,过氧化氢酶＜10U/mg蛋白 ＞20 4.30 186000 152000 A.niger p.notatum 葡萄糖氧化酶（GOD） 杂酶占试剂酶活性的%（允许限度） 比活性 (U/mg) 等电点 分子量 来源 名称 * 全国高等医药院校医学检验专业规划教材 　 临床生物化学检验 （第二版） 第五章　代谢物酶法分析技术 * 第五章 代谢物酶法分析技术 全国高等医药院校医学检验专业规划教材 　 临床生物化学检验 （第二版） 代谢物酶法分析技术是指用酶法分析的方法来测定人体內的代谢物或代谢产物的技术。 酶法分析（enzymatic method）是以酶为试剂测定酶促反应的底物、辅酶、辅基、激活剂或抑制剂，以及利用酶促反应测定酶活性的一类方法。 代谢物酶法分析技术的概念 代谢物酶法分析 平衡法（终点法） 速率法（动力学法） 代谢物酶法分析的理论基础 1 平衡法是指标本中待测物的量有限，经过酶促反应逐渐被消耗，当剩余的底物量很小（1%～5%）时，指示反应信号逐渐达到平衡，即通常所说的终点，所以又称为终点法(end-point method)。 平衡法的特点是测定底物的总变化量， 即测定的是“浓度”。 平衡法基本理论 (1) 速率法(rate assay)又称动力学法、连续监测法，测定的是速率（通常指的是初速度），依据是当底物的消耗量较小时(5%)，酶促反应呈一级反应，此时的反应速度（v）与代测物的浓度成正比例。 速率法的关键是如何使酶促反应成一级反应。 速率法基本理论 (2) 在临床操作中，只要测定期间待测物消耗 5%，只要测定两个固定时间的吸光度差值，就可以采用标准浓度对照法计算样本浓度，这种方法又称为固定时间法(fixed assay)。 速率法基本理论 (2) 平衡法的开始一段时间都有可能遵循一级反应规律。相反，速率法只要时间足够长，也会达到平衡。对于平衡法来说关键是确定达到平衡所需的时间。对于速率法来说关键是如何使酶促反应成一级反应。 平衡法与速率法的相互联系 返回章目录 酶作用的特异性高，血清等体液样品不需预处理就能测定，简化了实验程序； 试剂酶大多是蛋白质，没有毒性，避免了化学品对环境的污染； 酶促反应温和，制成试剂盒可适用于自动分析。 代谢物酶法分析主要优点 代谢物酶法分析在准确性、精密度、灵敏度和线性测定范围等方面都优于传统的化学法 代谢物酶法分析的方法 2 待测物与产物在理化性质上有便于检测的信号，如吸收光谱不同则可直接测定