分子杂交技术()培训教案.pptVIP

分 子 杂 交 原 理 及流 程 图 * * * * 分 子 杂 交 * * * * 分子生物学中用于检测生物样本中是否含有特定的生物分子（探针）的一门技术。 分 子 杂 交 原 理 及 流 程 图 样 品 制 备 电 泳 杂 交 转 膜 结果显示 探 针 制 备 * * * 分 子 杂 交 分 类 * * * ? Southern Blot ----DNA杂交 ? Northern Blot ----RNA杂交 ? Western Blot ----蛋白质杂交 ? 原 位 杂 交 * * * * 样 品 制 备 * * * * ? DNA 纯 化 ? RNA 纯 化 * * * * 探 针 制 备 * * * * 随机引物法合成高特异活性的DNA探针 ——NEBLot?Kit 特 点： * 活性高：≥109 dpm / ug * 标记效率高：可用于5 ng-2 ug的模板DNA量 模板量 用 途 基因文库筛选 Southern 杂交 Northern 杂交 原位杂交 随机引物法双链DNA探针合成标记优化技术 DECAprimeTMII Random Priming DNA Labeling Kit 优化技术： * 高纯度无外切酶活性的 Klenow酶提高了标记效率 10分钟完成反应 * 改进的标记动力学增加了探针产量 对低纯度及低浓度模板也能通过延长反应时间达到目的 * 独特的Decamer溶液提高引物-模板复合物稳定性 减少引物双体形成，提高了灵敏度 * 标记灵活：提供 dATP和 dCTP 两种标记缓冲液 特异性单链DNA探针合成标记优化技术 Prime-A-ProbeTM Strand Specific DNA Probe Synthesis Kit 活 性 大 于 4 × cpm / ug 109 合成高特异性全长RNA探针的最佳选择 ——MAXIscriptTM 体外转录试剂盒 特 点： * 可合成长达2kb的RNA * 产量可达2-4ug/ ul 同位素标记可达109 cpm/ug * 对应不同的启动子有不同的试剂盒可供选择 * 同位素或非放标记均可 多次洗脱反复杂交探针制备技术 ——Strip-EZTM System 专门为需要在同一张膜上反复标记检测不同信号的用户设计，提供非常温和的杂交信号洗脱条件，提高膜的使用寿命达通常的三倍左右。 工 作 原 理 合成探针的同时掺入经过修饰的dNTP (修饰不影响杂交特性） 杂交检测后将膜浸入探针降解缓冲液中将探针降解 68℃温和洗脱 适用于：Northern\Southern\dot/slot及相关杂交 Strip-EZTMRNA探针合成 Strip-EZTMRNA Probe Synthesis & Removal Kit 特 点： * 灵敏度高 比随机引物法DNA探针灵敏10倍以上 * 温和洗脱，提高膜寿命 * 不同启动子有不同试剂盒 * 同位素和非放标记均可 效 果 比 较 PCR 法Strip-EZTMDNA探针的合成 Strip-EZTM PCR Stripable DNA Probe Synthesis & Removal Kit 特 点： * 模板多样：克隆序列、cDNA、PCR产物 *不对称PCR技术，产物大多为单链DNA探针 *灵敏度高，比随机引物法高3-5倍 *提供除模板、标记物、Taq 酶外所有合成探针 及洗膜试剂，包括M13正反向及T7引物 cDNA dsDNA ssDNA ssRNA Oligo nucleotide ssRNA ssDNA dsDNA Oligo nucleotide Probe Type * * * * 标 记 类 型 * * * * ? 放射性同位素标记： 灵敏度高，成本低 但操作不便，标记效率不太稳定，寿命受半衰 期限制 ? 非放射性标记（地高辛、生物素、荧光素等）： 安全，标记稳定，探针寿命较长 但灵敏度较低，背景较高，成本高 非 放 射 性 杂 交 系 统 BrightStarTMPsoralen-Biotin Nonisotopic labeling Kit & BioDetectTM Nonisotopic Detection Kit 灵敏度最高的非放检测系统之一 ——BioDetectTM Nonisotopic Detection Kit 采用的化学发光剂CDP-Star为发光最强、发光时间最长的化学发光底物之一，灵敏度与同位素相当。 * 曝光1