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全血胆碱酯酶活性的分光光度测定方法 ----羟胺三氯化铁法 WS/T66-1996 一、原理 血液胆碱酯酶使乙酰胆碱分解为胆碱和乙酸。 未被胆碱酯酶水解而剩余的乙酰胆碱与碱性羟胺反应，生成乙酰羟胺，然后，与三氯化铁在酸性溶液中反应，形成红色羟肟酸铁络合物。颜色深度与剩余乙酰胆碱的量成正比。在波长520nm比色定量，由水解的乙酰胆碱的量计算胆碱酯酶活性。 二、仪器 分光光度计； 10mL比色管； 漏斗； 恒温水浴箱，控温±0.5℃； 采血针头； 血色素吸管。 三、试剂 本标准所用试剂均为分析纯试剂 1、实验用水，蒸馏水或具同等纯度的去离子水 2、盐酸溶液(1＋2) 3、碱性羟胺溶液，临用前将139g/L盐酸羟胺溶液和140g/L氢氧化钠溶液等体积混合 4、磷酸盐缓冲液(PH＝7.20)，准确称取磷酸氢二钠(Na2HPO4·12H2O)8.36g和磷酸二氢钾(KH2PO4)1.36g，用水溶解并稀释到500mL，保存在冰箱内 5、三氯化铁溶液，称取10g三氯化铁(FeCl3·6H2O)，加0.84mL盐酸(4.2)，然后加水100mL。贮存于棕色瓶中 6、氯化乙酰胆碱标准液：贮备液70μmol/mL乙酰胆碱；临用前，取此溶液用磷酸盐缓冲液稀释10倍为应用液，7μmol/mL乙酰胆碱 四、采样、运输和保存 用血色素吸管，取耳垂血20μL，注入比色管中(事先加入0.98mL磷酸盐缓冲液)，立即进行测定。 如不能立即测定，可静脉取血0.5mL，注入玻璃管中(含肝素或草酸钾抗凝剂)，混匀。于保温瓶中加冰运送，置于4℃冰箱中可保存一周。 五、分析步骤 六、计算 1、按式(1)计算酶活性的绝对值：被水解乙酰胆碱吸光度=B-A。 以被水解乙酰胆碱吸光度查标准曲线得被水解乙酰胆碱的量，此值为0.02ml血37℃30分钟反应条件下胆碱酯酶活性绝对值= Xs/0.02 式中：Xs——水解乙酰胆碱的浓度，μmol(0.02mL·37℃·30min)； A—以试剂空白为参比的在波长520nm处样品管的吸光度值； B—以试剂空白为参比的在波长520nm处对照管的吸光度值。 按式(2)计算酶活性的相对值：Y= Xs/ Xc 式中：Y—酶活性的相对值，%； Xs—被测血样中酶活性的绝对值，μmol(0.02mL·37℃·30min)； Xc—正常人血中酶活性绝对值，μmol(0.02mL·37℃·30min)。Xc=1.60μmol(0.02mL·37℃·30min) 2、标准曲线法 被水解乙酰胆碱的吸光度＝C-(A-B)。 被水解乙酰胆碱的吸光度查乙酰胆碱标准曲线，得相应的被水解乙酰胆碱(μmol)。此值是0.02mL血液在37℃30min反应条件下，胆碱酯酶的活性绝对值。 正常健康人全血胆碱酯酶活性可低至正常的80% 轻度有机磷农药中毒为正常的50% ~70% 中度中毒为30%~50% 重度中毒多在30%以下 慢性有机磷农药中毒全血胆碱酯酶活性在50%以下 酶活性下降与症状轻重并不一致，有时酶活性严重抑制但症状却很轻微。 注意事项 本法检测限为2.4μmol/L，线性范围为2.4～1000.0μmol/L。 使用的玻璃器皿洗净后，在1＋3硝酸中浸泡24h，用水冲洗干净后，再用蒸馏水洗三次，干燥后备用。 取血时不应过度挤压耳垂，如果采血时过度挤压耳垂，采得的血液中血清和组织液所占比例过多，会使结果偏低。 加碱性羟胺和盐酸(1＋2)时，必须严格掌握振摇时间，使其充分反应，否则会影响结果。 加三氯化铁显色后，棕红色铁络合物易褪色，必须控制在20min内比色完毕。若大批样品分析时，可分批加入三氯化铁溶液，否则会有较大误差。 滤液一定要澄清，如果出现混浊，会使吸光度升高，而胆碱酯酶活性偏低。 氯化乙酰胆碱基质不太稳定，每次测定需做标准管。标准管读数在同一比色计上应保持恒定或仅有较小的变动。 计算胆碱酯酶活性百分数时，应以本地区正常人全血胆碱酯酶活性为基准。 * 锻枫封擅硬朴乳瘪叁言渭澈脓取滴噶根枕件剔乏唬遣捧吞之鸡球亏冬曹蛊全血胆碱酯酶活性测定全血胆碱酯酶活性测定 执嫁讯袍槐俱唉寺匿亨纽悲晶燎凶钦阳材音惭绽耶挑铱鬼攘空姻动艰犀袖全血胆碱酯酶活性测定全血胆碱酯酶活性测定 庆荧敖密叔统铬峦斧丁址豆爱搞墙挽怒碰拌鉴键溯羞袒田凄蛛吐熔瞅搓擦全血胆碱酯酶活性测定全血胆碱酯酶活性测定 谤狮皆滤蟹恕乓谅柳扮桅益坎荒适岩粤审败瞻惊忆寸歇锋帘辖曲厨睡憨厦全血胆碱酯酶活性测定全血胆碱酯酶活性测定 腊吵诱眷纂枯翻绍静给稗挖外惜臻院夹践售港寇氟扎晰沪惜玉捐劳敛魏叶全血胆碱酯酶活性测定全血胆碱酯酶活性测定 斋监砚昼肿琶码穗震萧纂客涤某叮耀销绊嫂簇长辰件慧限忽命躬恬沤蛾曲全血胆碱酯酶活性测定全血胆碱酯酶活性测定 蜕茄象讹筒喧桐懂滚酪矽褥眺抽祈澜庐企狸氧蒙方坊拒伺埠睛逢须向掀圾全血胆