受体优秀培训书.pptVIP

* 拮抗剂(antagonist)： 通常是指能抵抗激动剂作用的药物，拮抗剂与激动剂作用于同一受体分子，呈竞争性或非竞争性结合。 pA2：代表由功能实验获得的可逆性竞争性拮抗剂的pKd值。使激动剂EC50增大1 倍所需的拮抗剂的浓度，以其10为底的负对数值表示。 KB与pKB： 与pA2一样，代表由功能实验获得的可逆性竞争性拮抗剂的pKd值。 与pA2的差别只是在作Schild作图时假设斜率为1.0。 竞争性拮抗剂与受体的亲和性通常采用Schild作图法求得 原理: 在一定浓度竞争性拮抗剂存在下，激动剂的浓度-效应曲线平行右移，拮抗 剂的亲和性越高，右移越多。 方法:1.pA2 通常采用3个以上浓度的拮抗剂. Schild方程为lg(dr－1)=lg[B]－lgKB, dr:相应浓度拮抗剂(B)存在时浓度－效应曲线的EC50值与对照浓度－效应曲 线的EC50值的比值，也称为剂量比(dose ratio)。以拮抗剂浓度的对数 值为横坐标，以相应浓度拮抗剂的剂量比－1的对数值 (lg (dr-1))为纵 坐标, 得一直线, 其与横坐标的交点即为代表该拮抗剂亲和性的pA2值 Schild方程: lg(dr－1) = lg[B]－lgKB, 如果拮抗剂与受体仅有单一位点的结合，斜率应为1.0。此时仅需用一种拮抗剂浓度，即能得到上述直线，由此方法到的拮抗剂亲和性称KB B为所用拮抗剂的浓度，dr的意义同上。 2.pKB [B] KB = dr－1 放射配体结合测定法 (Radioligand binding assay) 利用受体与配体特异性结合的特性，将被研究受体的特异性配体标记上同位素，放射性配体与组织(细胞膜、细胞浆)或细胞一起温育，然后采用一定的方法将与受体结合的放射性配体与游离的放射性配体分离，根据放射性配体与受体结合的情况来判断受体的数量、亲和性等。 最常用的两种方法是Scatchard 分析与竞争抑制实验。 饱和实验与Scatchard分析 采用不同浓度的放射配体(6～12个浓度）与组织或细胞在有受体拮抗剂存在(非特异性结合管）和无拮抗剂存在(总结合管)条件下温育一定时间，分离与受体结合的放射性配体。 特异性结合量用mol/mg蛋白、特异结合位点/细胞表示 受体放射配体结合测定计算公式 L + R LR [L] [R] = Kd[LR] Bmax= [R]+[LR] = [R] + Y X=[L] Y=[LR] X * (Bmax - Y) =Kd * Y Y= Bmax* X Kd + X 25068 1185579 20880 599960 16812 281528 13110 158302 6493 74582 4600 39865 Bound (cpm) Ligand (cpm) 54970 Kd 29420 Bmax Y= Bmax* X Kd + X 理想状态下的非线性回归 y= B * x K + x B= 最大结合容量(fmol/mg蛋白) *蛋白浓度(mg/ml)*所用蛋白体积(ml) *比放射性(dpm/fmol)*衰变系数*计数效率 K1 K2 Bmax y = 结合受体量(fmol) *比放射性(dpm/fmol)*衰变系数*计数效率 K2 x = 有效配体浓度(fmol/ml) *配体体积(ml) *比放射性(dpm/fmol)*衰变系数*计数效率 K2 X K3 Y 一种浓度的放射性配体及多种浓度的未标记配体(14～16种浓度)，与组织或细胞在一定条件下温育，分离与受体结合的放射性配体。 未标记配体与放射性配体竞争性与受体结合，未标记配体的浓度越大，与受体结合的放射性配体的量越少，依此可得竞争抑制结合曲线 。 竞争抑制结合实验 One Site Competative Curve a 1B -AR -10 -9 -8 -7 -6 -5 -4 0 50 100 lg[5-MU(mol/L)] Specific Binding % 受体与竞争性拮抗剂的亲和性 受体亚型分析 计算受体的Bmax和Kd值 -10 -9 -8 -7 -6 -5 0 20 40 60 80 100 BMY 7378 protected Control BMY 7378 Specific 125 IBE binding (%) 0 One Site Competative Curve a 1B-AR