第十四章 基因工程制药工艺.ppt

温度 DO pH 14.3. 2 培养工艺与控制 基因工程制药 培养与控制 1、温 度 大肠杆菌和酵母生长最低温度为10℃ 大肠杆菌生长最适温度为37℃，最高温度为45℃ 酿酒酵母：生长最适温度为30℃，最高温度为40℃ 基因工程制药 培养与控制 符合三基点原则：最低、最适、最高 温度对工程菌产物合成的影响 生长与生产温度不一致 较高温度表达量达，易形成包涵体 策略：较低温度下有利于表达可溶性蛋白质 对于热敏感的蛋白质，高温会降解破坏 策略：生产期可采用先高温，后低温，变温 表达，避免蛋白质降解 基因工程制药 培养与控制 温度控制 两端变温发酵培养： 前期； 较高温度发酵，获得足够高的菌体密度 后期：较低温度发酵，对菌体合成目标产物抑制不明显， 但可有效抑制目标产物的降解和包涵体形成，总体提高 工程菌的生产能力。 温度诱导型大肠杆菌表达系统：生长维持37℃，生产期 提高温度为42℃ 基因工程制药 培养与控制 2、pH值对发酵的影响 细菌喜欢偏碱性，真菌偏酸性 影响产物稳定性，最适生长和生产批pH不同 干扰素是在酸性条件下稳定，而在碱性条件下容易被 降解。 基因工程制药 培养与控制 一般情况下，目标产物对宿主菌是不利的 通用策略：诱导表达 根据启动子类型和目标产物表达调控模式而定 当产最大时，结束发酵 14.3. 3 产物诱导表达与终点控制 基因工程制药 培养与控制 思考题： 1、表达质粒载体的基本特征 2、酵母含有那四类表达载体 3、基因工程大肠杆菌构建的基本过程 4、工程菌的筛选鉴定 5、工程菌的质量控制 6、基因工程菌发酵培养基的组成 基因工程制药 培养与控制 （4）PCR扩增反应体系组成 成分 浓度 用量 作用 缓冲液 10× 5mL 提供反应环境 dNTPs 20mmol/L 1mL 反应的底物 正向引物 20mmol/L 2.5mL 扩增的起始点 反向引物 20mmol/L 2.5mL 扩增的终止点 DNA聚合酶 1～5U/mL 1～2mL 催化，热稳定 MgCl2 1～5mmol/L 1mL 辅酶 模板DNA 5～10mL 含目标基因序列 H2O 27～33mL 稀释 总体积 50mL 基因工程制药 大肠杆菌的构建技术 （5）PCR扩增产物 反应 变性 退火 聚合 循环数 第一个反应 94℃，5min 1 第二个反应 94℃，30s 55℃，30s 72℃，1min 30-35 第三个反应 94℃，1min 55℃，30s 94℃，7-10min 1 基因工程制药 大肠杆菌的构建技术 概念：在特异位点上催化dsDNA分子的断裂，产生相应的限制性片段。 酶切体系组成：目标和质粒DNA，缓冲液，限制性内切酶。 反应条件：适宜温度(37℃)，1小时以上。 终止反应：加热；加入EDTA，螯合镁离子。 电泳检查：酶切完全性。 2、酶切反应 基因工程制药 大肠杆菌的构建技术 粘性末端 平头末端 基因工程制药 大肠杆菌的构建技术 3、连接反应 概念： DNA 双链上相邻的3′-羟基和5′-磷酸基因共价结合形成3′-5′-磷酸二酯键，使原来断开的DNA缺口重新连接起来。 连接体系：载体片段与基因片段，缓冲液，连接酶。 连接反应：16℃-26℃，数小时，或过夜。 终止反应：在70℃加热10分钟。 基因工程制药 大肠杆菌的构建技术 基因工程制药 大肠杆菌的构建技术 4、转化 转化：把外源基因导入宿主细胞的过程； 某一基因型细胞从周围介质中吸收另一基因型细胞的DNA，使其基因型和表型发生相应变化的现象 基因工程制药 大肠杆菌的构建技术 大肠杆菌转化——CaCl2法 感受态细胞制备： 将培养液转入离心管中，冰上放置10 分钟，然后于4℃下离心10 分钟。 弃去上清，用预冷的0.05mol/L 的CaCl2 溶液10ml 轻轻悬浮细胞，冰上放置15-30 分钟后，4℃下，离心10 分钟。 加入连接反应产物：混匀，置冰上30分钟。 热击：42℃，90s； 置冰上，1－2分钟。 扩增培养：加入LB培养基，37℃，45分钟。 涂平板：含有抗生素的LB固体培养基上。 筛选培养：37℃，出现菌落。 基因工程制药 大肠杆菌的构建技术 感受态细胞制备：E.coli经Cacl2处理（0～5℃），使细胞膜通透性增加，从而具有摄取外源DNA的能力。 5、筛选与鉴定 非转化子：没有导入外源DNA的非转化宿主细胞 转化子：导入外源DNA的转化细胞 非重组子：仅含有空载体分子的转化子 重组子：含有重组DNA分子的转化子 目标重组子