疏水层析填料.docVIP

2008-6 Volume 8 疏 水 层 析 填 料 疏水层析，是根据不同的蛋白与疏水表面产生的相互作用的差异，进行蛋白分离的一种方法。一般而言，离子强度（盐浓度）越高，物质所形成的疏水键越强。影响疏水作用的因素包括：盐浓度，温度，pH，表面活化剂和有机溶剂。疏水层析的应用与离子交换层析的应用刚好互补，因此，可以用于分离离子交换层析很难或不能分离的物质。 Chisso公司生产的疏水层析填料，有三种类型：CellfineTM Butyl, Phenyl 和Octyl，分别为在多孔的交联纤维素颗粒上通过一个短接头，共价键和丁基，苯基或者辛基的层析填料。结构见下图： 填料的疏水性按丁基、苯基、辛基，疏水性程度依次增大。通常，CellfineTM Octyl对疏水性蛋白的吸附性会强于CellfineTM Butyl对疏水性蛋白的吸附。然而，蛋白被吸附的越厉害，也就越难洗脱。CellfineTM Phenyl，具芳香族物质的特性，因此，在某些情况下，可以更好地吸附丁基和辛基等脂肪族所不能吸附的物质。在使用疏水层析分离物质时，没有通法，只能根据待分离物质的特性，筛选合适的填料，摸索优化其分离纯化的条件。 三种疏水层析填料的疏水性差异（左图） 色谱柱：8.2 x 150 mm 柱体积：8 ml 流动相：2.0 – 0.0M Ammonium Sulfate in 0.01M phosphate, pH 7.0 流 速：1.32 ml/min 样 品：5 mg/3 ml– 100 μl 2008-6 Volume 8 Asahipak NH2P 色谱柱（氨基柱） Asahipak NH2P色谱柱是Shodex公司生产的用于分析糖类物质的正相柱。Asahipak NH2P色谱柱，是以聚合物为基材的氨基柱，化学稳定性良好，在pH2-13的条件下均可使用。与硅胶基材的氨基柱相比，聚合物基材的氨基柱Asahipak NH2P，可以很好地实现硅胶基材氨基柱的各种应用；对流动相的耐受性更好，使用寿命更长久；另外，Asahipak NH2P可用于定量分析；还可以用碱性溶剂冲洗。 聚合物基材氨基柱与硅胶基材氨基柱的柱寿命比较 左图为Asahipak NH2P色谱柱与硅胶基材氨基柱的寿命对比试验。结果显示：随着使用时间的延长，硅胶基材氨基柱对单糖、二糖的保留快速下降，其原因应是硅胶基材氨基柱的氨基降解所致。 色谱柱：Asahipak NH2P-50 4E, 其它公司的氨基柱 (4.6mmID*250mm) 流动相：CH3CN/H2O=75/25 流 速：1.0mL/min 检测器：Shodex RI 柱 温：30度 Asahipak NH2P色谱柱可在正相模式下分离糖类物质，糖类物质按照分子量由小到大的顺序依次被洗脱。增加洗脱液中有机溶剂的比例可以延迟糖类的洗脱时间。Asahipak NH2P色谱柱可以在碱性，室温条件下分离单糖、二糖和糖醇混合物。右图为Asahipak NH2P色谱柱分离单糖、二糖及三糖混合物的应用实例。 单糖、二糖及三糖混合物的分离 色谱柱：Shodex Asahipak NH2P-50 4E (4.6mmID*250mm) 流动相：H2O/CH3CN=25/75 流 速：1.0mL/min 检测器：Shodex RI 柱 温：30度 2008-6 Volume 8 学 习 园 地 导致色谱柱柱压升高的原因及解决方案 第一阶段：确认是柱子导致的压力上升，还是HPLC系统导致的压力上升。 由于HPLC系统有很多环节，如泵、管路等，都容易吸附和积聚杂质，这些因素均会导致压力上升，所以，应先对HPLC系统进性排查。 排查方法：取下色谱柱，仅用管路连接并正常输送流动相时记录系统压力。如果此时HPLC系统压力正常，则考虑是柱压升高。 第二阶段：确定是否使用了保护柱（预柱）。 一般在测定容易堵塞色谱柱的样品时，应该使用保护柱。如果使用了保护柱，那么压力的升高就有可能是保护柱的柱压升高导致的。 排查方法：取下色谱柱，仅以保护柱连接管路并正常输送流动相测试柱压，再反过来取下保护柱仅以色谱柱连接管路正常输送流动相测试柱压，如果仅当连接保护柱时柱压高的话，则为保护柱引起的柱压升高，请清洗、或更换保护柱。 第三阶段：如果不是上述第一、第