浙江大学生物化学实验甲植物材料基因组DNA多态性分析.docVIP

植物材料基因组多态性分析 原理 一、RAPD技术的原理 RAPD技术是由美国的Williams等人于1990年发明的。它是以聚合酶链反应技术(PCR技术)为基础，利用人工合成的寡核苷酸为引物，以从组织中分离出来的基因组DNA为模板，通过基因放大器合成多态性DNA片段的一种方法。由于不同品种DNA序列存在着差异，其引物结合位点以及两结合位点之间的距离都有差异，这样经PCR扩增后就产生了DNA片段的多态性，从而形成了RAPD标记。RAPD标记具有以下特点： ⑴、标记数量多，因为RAPD分析所用引物的数量是无限的，所以它可以覆盖基因组中所有的位点。 ⑵、标记所需模板DNA量小，因此不受季节、组织、器官及发育时期的限制。 ⑶、所用引物没有物种限制，一套引物可以用于不同生物基因组分析。 ⑷、分析方便、快速、无需克隆自卑、同位素标记、Southern转移等复杂的操作。 ⑸、标记是显性的，因此不能区别生物个体是纯合型还是杂合型。 目前，RAPD技术已广泛用于基因定位，寻找特定基因的连锁标记，物种识别， 系统进化，遗传多样性检测，遗传作图和遗传育种等众多领域。 由于RAPD技术是以PCR技术为基础的，因此为了更好的掌握RAPD技术，有必要先了解PCR技术。 PCR技术的原理 多聚酶链式反应技术简称PCR技术，是近年发展起来的一种体外扩增特异 DNA片段的技术，此法操作简单，可在短时间内获得数百万个特异序列的拷贝，因此PCR技术虽然问世时间仅数年，但它已迅速渗透到分子生物学的各个领域。在分子克隆、遗传病的基因诊断、法医学、考古学等方面得到了广泛的应用。 PCR技术与细胞内发生的复制过程十分类似，为在模板DNA、引物（16bp以上，最好为20~24bp）和4种脱氧核糖核苷酸存在的条件下依赖于DNA聚合酶的酶促合成反应。按照反应的特点可将其分为三步：①、变性：通过加热使DNA双螺旋的氢键断裂，双连解开形成单链；②、退火：当温度突然降低时由于模板分子结构较引物要复杂的多，而且反应体系中引物DNA量大大多于模板，使引物和其互补的模板在局部形成杂交链，而模板DNA双链之间互补的机会较少；③、延伸：在DNA聚合酶和4种脱氧核苷三磷酸底物及Mg2+存在的条件下，由DNA聚合酶5’→ 3’的聚合酶活性催化以引物为起点的DNA链延伸反应。以上3步为一个循环，每一循环的产物均可作为下一个循环的模板，数小时之后，介于两个引物之间的特异性DNA片段将得到大量的复制，数量可达到2×106~7拷贝。 如图所示，经过高温变性，低温退火和中温延伸3个温度的循环，模板上介于两个引物之间的片段不断得到扩增。每循环一次，目的DNA的拷贝数加倍，随着循环此数的增加，目的DNA以2n的形式堆积。PCR扩增的特异性是由人工合成的一对寡核苷酸引物所决定的。在反应的最初阶段，原来的DNA担负着起始模板的作用，随着循环次数的递增，由引物介导延伸的片段急剧地增多而成为主要模板。因此，绝大多数扩增产物将受到所加引物5’末端的限制，最终扩增产物是介于两种引物5’之间的DNA片段。 RAPD的原理 RAPD技术通常是利用一系列（通常数百个）不同碱基顺序随机排列的寡聚核 苷酸单链（通常为10bp）为引物，对所研究基因组DNA进行PCR扩增。RAPD所用的一系列引物DNA序列各不相同，但对于任一一对特定的引物（可相同也可不同），如它们同基因组DNA序列有其特定的结合位点，这些特定的结合位点在基因组某些区域内的分布如符合PCR扩增反应的条件，即引物在模板的两条链上有互补位置，且引物3’端相距在一定的长度范围之内（200~2000bp），就可扩增出DNA片断。因此如果基因组在这些区域发生DNA片断插入、缺失或碱基突变就可能导致这些特定结合位点分布发生相应的变化，而使PCR产物增加、缺失或发生分子量的改变。通过对扩增产物的检测即可测出基因组DNA在这些区域的多态性，由于进行RAPD分析时可用引物数很大，虽然对每一对引物而言其检测基因组DNA多态性的区域是有限的，但是利用一系列引物则可以使检测区域几乎覆盖整个基因组，因此RAPD可以对整个基因组DNA进行多态性检测。两个物种的个体之间，亲缘关系越接近，其相应的PCR扩增带型也就越相似，反之则差异也就越悬殊。 二、多态性DNA随机放大的条件 大多在Williams等（1990）的基础上变动。一般每一个样品的最后混合液为 25ul，其中含25ul 10×的DNA聚合酶缓冲液（由Tris-HCl，KCl，MgCl2和明胶等配成），各占100umol/L的dATP、dGTP、dCTP和dTTP，0．2umol/L的引物，20~25ng的模板DNA和0．5单位酶量的DNA聚合酶，然后用蒸馏水将混合物加到25ul。 三、影响RAPD的因素 1、