亚甲基四氢叶酸还原酶基因多态性与乳腺癌新辅助化疗敏感性关系的.ppt

◆ 研究目的和意义 ■目的：研究亚甲基四氢叶酸还原酶（MTHFR）基因 C677T、A1298C多态与乳腺癌患者对新辅助 化疗敏感性的关系。 ■意义：寻找可靠的预测指标指导个体化治疗, 从而 为进一步实现乳腺癌规范化综合治疗提供参 考依据。 ◆ 研究对象 ◆ 评定标准 ▲ 化疗疗效的评定标准： 参照WHO实体瘤疗效评定标准 分为完全缓解(CR)、部分缓解(PR)、无变化(SD)和进展(PD)。 ▲ 化疗后病理反应分级标准 ◆ 实验技术路线 §试剂: 4×dNTPs（宝生物工程(大连)有限公司)) 引物（宝生物工程(大连)有限公司) Taq 酶(北京博瑞科技有限公司) 限制性内切酶Hinf I(宝生物工程(大连)有限公司) 10×Buffer(宝生物工程(大连)有限公司) §仪器: PCR 扩增仪两台(美国MJ公司，德国Biometra公司) 冷冻高速离心机(0～16000r/min) (德国Eppendorf公司) 可调式移液器(0～2μl, 0～100μl, 0～1000μl)(GILSON公司) PCR扩增MTHFR 677基因片段 (198bp) MTHFR 677基因型检测 （Hinf I酶切PCR扩增产物） 结果判断 ● 结果判断 1）当为677C/C基因型时， PCR产物不能被限制性内切酶Hinf I 酶所识别，PCR产物则不能被消化，琼脂糖凝胶上表现为198bp片段，可清晰见到198bp一条亮带。 2）当为677T/T基因型时，PCR产物被限制性内切酶Hinf I酶消化后可产生175bp、23bp二个新的片段。其中23 bp的片段由于太短而无法在凝胶上清楚的显示，故琼脂糖凝胶上只可清晰的见到175bp一条亮带。 3）当为677C/T基因型时，可产生198bp、175bp、和23bp三个片段。其中23bp的片段由于太短而在凝胶上无法清楚显示，故琼脂糖凝胶上只清晰见到198bp和175bp两条亮带。 ● Hinf I酶切MTHFR 677基因DNA  片段产物电泳图 ▲ MTHFR A1298C基因多态性检测方法 §试剂: 4×dNTPs（宝生物工程(大连)有限公司)) 引物（宝生物工程(大连)有限公司) Taq 酶(北京博瑞科技有限公司) 限制性内切酶Mbo Ⅱ（宝生物工程(大连)有限公司) 10×Buffer(宝生物工程(大连)有限公司) §仪器: PCR 扩增仪两台(美国MJ公司，德国Biometra公司) 冷冻高速离心机(0～16000r/min) (德国Eppendorf公司) 可调式移液器(0～2μl, 0～100μl, 0～1000μl)(GILSON公司) PCR扩增MTHFR A1298C基因片段 (84bp) MTHFR A1298C基因型检测 （MboⅡ酶切PCR扩增产物） 结果判断 ▲ 结果判断 1）当为1298A/A基因型时，PCR产物被限制性内切酶Mbo Ⅱ消化后可产生56bp、28bp二个新的片段。其中28bp的片段由于太短而在凝胶上无法清楚显示，故琼脂糖凝胶上只可清晰见到56bp一条亮带。 2）当为1298A/C基因型时，可产生84bp、56bp、和28bp三个片段。其中28bp的片段由于太短而在凝胶上无法清楚显示，故琼脂糖凝胶上只可清晰见到84bp和56bp两条亮带。 ▲ Mbo Ⅱ酶切MTHFR A1298C基因 DNA片段产物电泳图 ● MTHFR基因型和新辅助化疗疗效的关系(表1） ● MTHFR基因型与乳腺癌新辅助化疗病理反应率 的关系（表2） 一.MTHFR基因多态