动物细胞工程实验指导教材分析.doc

实验时间 实验内容 4月11日 实验一 培养用液的配制、除菌与分装 4月18日 实验二 细胞的传代培养 4月25日 实验三 鱼类细胞原代培养（组织块法）（1-5组）401 实验四 染色体制备（6-10组）301 5月2日 实验三 鱼类细胞原代培养（组织块法）（6-10组）401 实验四 染色体制备（1-5组）301 5月9日 实验五 细胞的复苏 实验一 培养用液的配制、除菌与分装 【实验目的】 掌握常见培养用液的配制方法。 掌握常用的灭菌方法。 了解每种培养用液的作用。 【实验原理】 常用细胞培养用液包括磷酸盐平衡盐溶液（Phosphate Buffered Saline，PBS）、液体培养基、胰蛋白酶（Trypsin）和EDTA溶液。PBS用于清洗细胞、配制胰蛋白酶和 EDTA。培养基含有细胞生长需要的各种营养元素，使用时通常还需填加血清和抗生素。鱼类细胞培养的培养基常用种类是MEM 和L-15；用于动物的一般是DMEM和RPMI-1640。胰蛋白酶可将贴壁的细胞从培养瓶壁上消化下来，通常使用浓度为0.25%或0.125%。EDTA 用于清洗细胞表面，螯合Ca2+等二价离子，使细胞易于为胰蛋白酶消化。 细胞培养用的试剂必需是无菌的，PBS和EDTA可以采用高压灭菌，而培养基和胰蛋白酶溶液含生物活性物质，配制好后通过过滤除菌。 【试剂、材料与仪器】 试剂：NaClKCl，Na2HPO4，KH2PO4，EDTA，胰蛋白酶HEPES，碳酸氢钠MEM或PRMI-1640培养基干粉GPS 材料：三蒸水，蒸馏水瓶，药匙，称量纸，烧杯（250 mL、1000 mL），玻棒，精密pH试纸（6.8-8.0），容量瓶（250 mL、1000 mL），移液管（5 mL、10 mL），一次性注射器，一次性过滤器，普镊，酒精灯，打火机，医用酒精，酒精喷壶，消毒纱布，已高压灭菌试剂瓶（500 mL、250 mL、100 mL），记号笔，标签纸，橡胶手套，封口膜 仪器：精密天平，超净工作台，加液枪，4℃冰箱 【实验分组】 实验分组进行，每组4人，每班20人，共分5组。配制PBS并高压灭菌，配制胰蛋白酶溶液并过滤除菌和分装，配制EDTA溶液高压灭菌并分装，配制培养基，过滤除菌培养基并分装。 每个实验小组需准备试剂有：胰酶 50 mL；EDTA 50 mL；培养基90 mL（使用前加入10 mL血清）。 【实验步骤】 1．PBS（1000mL）的配制 分别称取NaCl 8g；KCl 0.2g；Na2HPO4·12H2O 2.9g ；KH2PO4 0.2g于烧杯，加入800 mL三蒸水，玻棒搅动充分溶解后，倒入1000mL容量瓶中，用三蒸水定容至刻度。PBS用于2胰蛋白酶溶液和3 EDTA溶液的配制，余下高压灭菌备用。 2．胰蛋白酶溶液（0.25%）的配制、除菌与分装 称取0.625g胰蛋白酶于250 mL烧杯，加入1配制的PBS 200 mL，玻棒搅拌充分溶解后，倒入250 mL容量瓶中，用PBS定容至刻度。拿入超净工作台过滤除菌，并分装至5个试剂瓶（100 mL），每瓶50 mL。试剂瓶均在酒精灯火焰上烧口加盖，贴好标签，封口膜封口，放4 ℃冰箱保存备用。标签上标明：0.25%胰蛋白酶液、配制日期、以及组号与组长姓名。 3．EDTA（0.2％）的配制、除菌与分装 称取0.5 g EDTA 于250 mL烧杯，加入1配制的PBS 200 mL，溶解时加少量NaHCO3，调整pH为8.0，玻棒搅拌使EDTA充分溶解。再用 PBS定容到250 mL容量瓶里，终浓度为0.2%，调pH为7.2-7.4。装于250 mL试剂瓶中，高压灭菌备用。 在超净工作台内，将已灭菌的EDTA溶液分装至5个无菌试剂瓶（100 mL），每瓶50 mL。试剂瓶均在酒精灯火焰上烧口加盖，贴好标签，封口膜封口，放4 ℃冰箱保存备用。标签上标明：0.2% EDTA、配制日期、以及组号与组长姓名。 4．培养基的配制、除菌与分装 将培养基干粉（MEM或PRMI-1640）倒入1000 mL烧杯，加800mL三蒸水，玻棒搅拌充分溶解；再加入加1.8g HEPES和2.2g碳酸氢钠，玻棒搅拌充分溶解，溶液呈橙色（弱酸性，pH在7.0左右）；再倒入1000 mL容量瓶，用三蒸水定容至刻度。 工作前打开超净工作台上的紫外灯，灭菌30分钟后，关闭紫外灯，打开吹风和照明灯；带橡胶手套，用酒精擦拭消毒双手；超净工作台面用酒精喷洒，再用消毒纱布擦净。在超净工作台中摆放好试剂瓶和滤器。 将培养液拿入超净工作台过滤除菌，并分装至5个无菌试剂瓶（100 mL），每瓶90 mL，余下装入500 mL无菌试剂瓶，每瓶内需加入无菌的GPS（谷氨酰胺-青霉素-链霉素），轻轻摇匀，使之终浓