201186分析生理状态下NK细胞体外杀伤活性操作及结果.docVIP

实验日期：2011-8-6 实验目的：分析生理状态下NK细胞体外杀伤活性 实验方法：磁珠分选B细胞，LDH释放法体外确定转基因小鼠来源脾细胞（主要是B细胞）可被正常小鼠NK细胞杀伤且是NKG2D依赖性的。 实验流程： 第一步：猝死小鼠，冻存相关样品 取一只转基因鼠一只非转基因鼠，分别挖眼球取外周血，放于40C，以待收集外周血清，离心后吸取血清-700C冻存，做好记号。 猝死小鼠，放于75%的酒精浸泡。解剖小鼠，分别依次取淋巴结（腋窝部，腹股沟，肠系膜）、脾脏，肝脏、肺脏、胸腺、小肠和大肠（去尽肠内容物）、皮肤各一段，且分别放于预冷PBS中洗涤去除血渍。 脾脏和淋巴结制备单细胞悬液，其余组织用锡箔纸包裹后700C冻存。 第二步：脾脏、淋巴结单细胞悬液的制备（过程尽可能在冰上） 无菌操作取鼠脾脏，放在装有预冷PBS的平皿中漂洗去血渍剔除外膜。 移至另一无菌平皿中，将脾脏剪碎成1-2mm3的组织，研磨。 用PBS充分吹打组织直至细胞悬液中看不见明显组织块。 所得细胞悬液过200目滤膜过滤，滤液滤于离心管，加2ml PBS洗涤培养皿洗涤液继续过滤膜，滴入离心管。 离心沉淀，4℃ 1200rpm离心8分钟，弃上清。 以10倍细胞压积的比例(大约1ml)加入红细胞裂解液，混匀。 静止5分钟，大量PBS（8ml）冲洗，4℃1200rpm 离心8分钟，弃上清。 用适量PBS重悬细胞，计数，