第七章、质粒技术总结.ppt

第七章、质 粒 一、质粒的命名 二、质粒的遗传特性 三、质粒的分离、检测与纯化 四、质粒的复制和调节 五、质粒的稳定性 质粒（plasmid）大多是由DNA组成的环形分子，比宿主染色体小，在空间上与染色体隔开，能够自我复制的遗传结构，通常具有共价、闭合、环状DNA的基本特征。 有些质粒即可以整合进宿主染色体又可以游离在细胞质中，这类质粒又称为附加体。 一、质粒的命名 由3个英文字母和编号组成。 第1个小写字母“p”表示plasmid;后面的2个大写字母表示发现者或构建人、构建实验室的名称；最后是编号。如：质粒 pBR322 是由 Bolivar 和 Rodrigres 2位墨西哥学者所构建。 质粒的命名不能离开宿主，一般将质粒写在宿主名称后面的括号中，每一个质粒占一个括号。如： E.coli DH5α ( pBR 322 ) E.coli k12（F） 二、质粒的遗传特性 1、质粒的表型效应 质粒同染色体基因一样具有一定的表型效应。如：F因子最明显的表型是编码细胞壁外的性纤毛（sex pili），使细胞之间可以接合。 大肠杆菌素（colicin）因子，简称col因子，带有编码colicin的基因。 质粒R因子上带有抗药性基因，其宿主表现出对一种或多种抗菌素或药物的抗性。 假单孢菌中有些分解性质粒，带有分解酶类，可降解樟脑、辛烷、甲苯和二甲苯等物质。 放线菌的质粒 scp 不但是致育因子，同时还编码抗生素合成基因。 多数质粒不显示任何表型效应，至少目前的方法和手段还测定不出来，这些质粒称为隐秘质粒（cryptic plasmid）,许多细菌都有，并非无功能，只是尚未发现。 苏云金芽孢杆菌是著名的杀虫细菌，其杀虫晶体蛋白（Insecticidal crystal protein, ICP）基因在质粒上。 编码杀虫晶体蛋白基因多为 cry，还有 cyt 基因 不同的cry 基因杀虫活性不同 对杀虫晶体蛋白敏感的害虫有很多种，包括：鳞翅目、鞘翅目、双翅目等等。 图示苏云金芽孢杆菌以色列亚种的一个大质粒。 编码的杀虫蛋白基因有7个，其中3个为cyt基因， 4个为cry基因。 苏云金芽孢杆菌形成的杀虫晶体蛋白 苏云金芽孢杆菌杀虫晶体蛋白所作用的害虫 苏云金芽孢杆菌杀虫晶体蛋白所作用的蚊虫 2、质粒的大小，数量及复制类型 质粒的大小差别很大，在天然发现的质粒中，最小的只有2.3kb, 最大的质粒200kb。 质粒在细胞中的数量决定于拷贝数，而拷贝数又决定于复制类型。 拷贝数是指每一细胞中的质粒数量。F因子这类大质粒的拷贝数只有1－2个，其复制受到严格的控制。而col E1质粒的拷贝数在10－20个，证明其复制不受严格的控制。 拷贝数测定： 细胞中质粒的总量 / 质粒的分子量 复制类型: 严紧型（stringent control） 质粒复制受严格的控制。如F因子 松弛型（relaxed control） 质粒复制不受严格的控制。如col因子 松弛型质粒可以用一定的实验手段使其拷贝数大大扩增。如添加氯霉素方法。 3、 质粒的不亲和性 （Incompatibility） 不亲和性是指同一细胞中的质粒不能并存的现象。 本质相同的质粒不相亲和，所以质粒分为若干个不相容群。 不能共存在一个细胞中的质粒，属于同一不相容群，能共存的质粒属于不同的不相容群。 三、质粒的分离、检测与纯化 请自学此部分内容 四、质粒的复制和调节 1、质粒的复制 能够独立复制的单位称为复制子（replicon）。 质粒的复制以θ型复制为主，有单向和双向复制，以及滚环复制。复制所需蛋白主要来自寄主。 质粒的复制起始位点称为 ori V。 Ori 区域的功能： A.复制起始 B.决定宿主范围 C.决定拷贝数 2、质粒复制的调节 1）、抑制物—靶位调节 调节特点：依赖一小段反向转录的RNA作为抑制物，通过与目标RNA的互补结合阻止质粒复制起始。目标RNA可以是复制的引物，也可以是复制所需蛋白的mRNA。 以ColE1质粒为例： 大小为6.6kb,拷贝数10～20个，单向复制，完全 依赖宿主的复制酶系。 ColE1质粒复制需要一段RNA 引物， RNAII 为引物前体，需被RNase H切割加工后才有引物活性。 质粒本身编码2个负调节因子： 1) RNAI: 是反义