FnCBD64基因重组腺病毒载体AdFnCBD64的构建.docVIP

FnCBD64基因重组腺病毒载体Ad.FnCBD64构建的实验研究 徐瑞剑 王志强 包头市九原区医院胸外科 内蒙古包头 014060 内蒙古自治区自然科学基金项目 项目编号2009MS1148 通讯作者：王志强 Xu ruijian Wang zhiqiang Department of Thoracic Surgery, Jiuyuan District Hospital of Baotou, Baotou Inner Mongolia 014060 实验目的：构建纤维连接蛋白羧基端细胞结合域（FnCBD64）基因重组人腺病毒载体（Ad.FnCBD64）。实验方法：1.FnCBD64重组腺病毒粘粒载体的构建。2.293细胞和Hela细胞的培养。3.磷酸钙转染。4. 筛选和扩增FnCBD64基因重组腺病毒。5．设计公共PCR引物。6. 鉴定Ad. FnCBD64重组腺病毒。7. 浓缩纯化重组腺病毒。8. 测定病毒滴度（50％组织培养感染量TCID50）。9.体外安全性研究。结果：成功构建了纤维连接蛋白羧基端细胞结合域（FnCBD64）基因重组腺病毒载体Ad.FnCBD64。结论：本实验成功地构建了携带人FnCBD64基因的重组腺病毒，为应用FnCBD64促进骨髓间质干细胞的黏附力提供了转染载体，使应用骨髓间质干细胞体外构建组织工程心脏瓣膜成为可能。 运用基因转染的技术加强及改造种子细胞的功能是组织工程研究中的热点问题之一。通过这一手段的应用，不仅能获得具备旺盛生理功能的种子细胞，而且还能使种子细胞大量表达需要的目的蛋白，有利于组织构建。腺病毒载体是组织工程基因改造的常用的病毒性载体，同其他的载体体系对比，腺病毒载体是最具有潜力的载体之一，具有高效感染分裂细胞及非分裂细胞能力，制备容易、纯化和储存方便，并且滴度高、容量大[1]。能插入大片段的目的基因，携带的外源基因不会整合在宿主染色体中，在靶细胞内以附加体形式存在，插入突变的危险极低，具有较低的遗传毒性。腺病毒能够高效地在体外途径进行基因转移，容易操作[2]；病毒转染24小时以后就有相当数量的重组基因表达，且持续时间长，可达14天以上，这与使用种子细胞体外构建组织工程心脏瓣膜所需要的时间相一致，病毒载体可在体外对种子细胞进行基因改造，以满足我们的需要，用于构建组织工程心脏瓣膜。 1 材料与方法 1.1材料 1.1.1试剂 限制性核酸内切酶（BioLabs公司），DNA分子量标准品、PCR试剂（TaKaRa公司），DNA包装蛋白（Novagen公司），高糖DMEM培养液、PRMI1640培养液、胎牛血清（FCS）（GIBCO公司），PCR引物（上海生工生物工程有限公司），新生小牛血清（NCS）（杭州四季清公司），BES（N-2-羟乙基-2-氨基乙磺酸）（CNI公司），胰酶、二甲基亚砜（DMSO）（Sigma公司），Sephadex G-50介质（Amersham Pharmacia公司），氯化钙（CaCl2）、氯化铯（CsCl2）（Amresco公司），硫酸链酶素（上海四药股份有限公司），青霉素钠（上海先锋药业有限公司）等。 1.1.2主要仪器 电泳仪PhastSystem（Pharmacia Biotech公司），恒温烤箱（Fisher公司），CO2培养箱BB5060（Hereaus公司），PCR仪 GeneAmp PCR System 2400（PERKIN ELMER公司），RC-26低温高速离心机（杜邦公司），MDF3820 -70℃低温冰箱（SANYO公司），TGL-16C台式离心机（上海安亭科学仪器厂），12孔排枪、枪头、Eppendorf管（BIOHIT公司），Olympus IX-70倒置相差显微镜（日本奥林巴斯公司）等。 1.1.3细胞 人胚肾293细胞（ATCC CRL1573），Hela细胞（中国科学院上海细胞所）。 1.2实验方法 1. 构建FnCBD64重组腺病毒粘粒载体：(1) FnCBD64 DNA片段回收及加工(2)粘粒载体pAxCAwt酶切及纯化(3)目的粘粒载体重组pAxCAwt. FnCBD64的获得(4) 鉴定和扩增pAxCAwt. FnCBD64。 2. 293细胞及Hela细胞培养。(1)常规培养：于含10％血清培养基中（293细胞使用DMEM的培养液，HeLa细胞使用1640的培养液），37℃及5％CO2条件下进行培养。传代：对数生长期细胞，0.25%的胰酶消化制成细胞悬液，按一定浓度加入新瓶中培养。(2)冻存：取对数生长期细胞，0.25%的胰消化酶制成细胞悬液，离心，弃上清，加入1ml冻存液，打匀制成细胞悬液，细胞浓度为106-107/ml。转移至细胞冻存管，按顺序4℃1小时，-20℃2小时，-80℃4小时，而后置液氮中长