第七章细胞重组与细胞融合技术总结.ppt

原生质体的培养 ①液体培养 液体浅层培养 ② 固体平板法 ③ 固液双层培养法 ? 琼脂糖珠培养 原生质体活力检测 ?染色法 ? FDA法：FDA（二乙酸荧光素）能穿越细胞质膜，被活细胞内的酯酶裂解，在荧光显微镜下发荧光（荧光素）。 ?伊凡蓝法：伊凡蓝不能穿过质膜，但质膜受到严重损坏使细胞被染色。 ?胞质环流法：是否存在胞质环流判断原生 质体活力； ?渗透压变化法：活原生质体会随着外界渗透压的变化体积变化 ?氧电极法：活原生质体在光照下光合放氧，无光呼吸耗氧 密度梯度离心：用一定的介质在离心管内形成一连续或不连续的密度梯度，将细胞混悬液或匀浆置于介质的顶部，通过重力或离心力场的作用使细胞分层、分离。 密度梯度离心又可分为速度沉降和等密度沉降平衡两种 1、速度沉降主要用于分离密度相近而大小不等的细胞或细胞器。这种沉降方法所采用的介质密度较低，介质的最大密度应小于被分离生物颗粒的最小密度。生物颗粒（细胞或细胞器）在十分平缓的密度梯度介质中按各自的沉降系数以不同的速度沉降而达到分离。 2、等密度沉降适用于分离密度不等的颗粒。细胞或细胞器在连续梯度的介质中经足够大离心力和足够长时间则沉降或漂浮到与自身密度相等的介质处，并停留在那里达到平衡，从而将不同密度的细胞或细胞器分离。介质的最高密度应大于被分离组分的最大密度，而且介质的梯度要求较高的陡度，不能太平缓。这种方法适于分离细胞器，而不太适于分离和纯化细胞。 速度沉降 等密度沉降 三、细胞器转移 细胞器转移是将一个物种的细胞器转移到另一个物种细胞中的技术。 细胞器转移类似细胞核移植技术。不同的是操作对象为细胞器，不是细胞核。 最常见的是线粒体和叶绿体的细胞器转移。 细胞器转移方法有微注射、载体转移、胞吞胞饮等方式。 四、胞质杂种 概念一：将两种不同来源的核外遗传物质（线粒体和叶绿体）与一个特定的细胞核组合在一起得到的细胞称为胞质杂种。 概念二：来自两个原生质体融合产生的细胞，其中一个细胞的细胞核消失后，两个亲代原生质的细胞质杂交得到的个体成为胞质杂种。 核心概念是细胞质的杂交，不是细胞核，其中细胞质中存在不同来源的细胞器，尤其是线粒体和叶绿体。 细胞融合 细胞融合(Cell fusion)：又称体细胞杂交，是指使用人工方法使两个或两个以上的体细胞合并形成一个细胞，使之分化再生，形成新物种或新品种的技术。 细胞融合方法包含人工方法和无性方法 1、人工方法：是指在外力使用诱导剂或促融剂、电场、磁场、超声波、重力、激光等因素的作用。 2、无性方式：是区别于有性方式而言的，有自然条件下，生殖细胞卵子和精子相互接触会发生细胞融合的现象。 1838-1875年：在血液组织中发现有多核细胞； 20世纪50年代：日本科学家发现仙台病毒可以引起细胞的融合； 1965年：英国的科学家海利斯成功得到了融合细胞； 1964年：HAT（次黄嘌呤(hypoxantin)、氨基蝶呤(aminopterin)和胸腺嘧啶脱氧核苷(thymidin) ）选择培养基应用于融合细胞的选择； 1974年：加拿大华裔科学家高国楠发现聚乙二醇（PEG）能够促使 植物的原生质体融合； 1982年：出现了电融合技术； 近20年：从细胞融合的理论和实践两个方面进行了大量研究，细胞融合的方法不断更新和完善，融合率逐步提高。 细胞融合技术的发展史 生物种类 细胞来源 成功年代 烟草两个种间 苷蓝——青菜 大豆——马唐草 矮牵牛——龙面花 大麦——花生 大麦——大豆 小麦——矮牵牛 油菜——大豆 玉米——大豆 大豆——野豌豆 大麦——蚕豆 大豆——草香木犀 酵母菌——鸡 大豆——烟草 大豆——秋水仙 人——胡萝卜 番茄——马铃薯 人——小鼠 叶——叶 叶——根 愈伤组织——叶 叶——花瓣 种子——种子 叶——悬浮细胞 叶——花瓣 叶——悬浮细胞 叶——悬浮细胞 悬浮细胞——悬浮细胞 叶——根 悬浮细胞——叶 原生质体——血红细胞 悬浮细胞——叶 悬浮细胞——叶 腹水癌细胞——原生质体 叶——根尖 纤维肉瘤细胞——畸胎瘤细胞 1972 1972 1972 1973 1974 1974 1974 1974 1974 1974 1975 1976 1976 1976 1976 1976 1978 1978 几种细胞融合成功的例子 细胞融合的类型 异核体：来自两个不同基因型的细胞融合成的融合细胞。 同核体：基因型相同的细胞融合成的融合细胞。 细胞融合包括对称融合和不对称融合。 1、对称融合：两个完整的细胞间的融合。 2、不对称融合：其中一个细胞通过物理、化学或者生物的方法使该细胞的细胞核或者细胞质失活后再与另一个完整的细胞进行的融合。 细胞融合的过程 1、两原生质体或者细胞彼此靠近； 2、质膜融合形成细胞桥； 3、胞质渗透； 4、细胞