minRNA检测方法.doc

microRNA（miRNA）是一种机体内源性表达的单链小分子RNA，位于基因组非编码区，本身不具有开放阅读框（open reading frame，ORF），具有高度保守性，时序性和组织特异性。miRNA广泛存在于各种真核细胞中，不编码任何蛋白质，长度仅为20～24nt。成熟的miRNA 5′端有一个磷酸基团，3′端为羟基，由具有发夹状结构的约70～90nt的单链RNA前体经过Dicer酶加工后形成。成熟的miRNA形成RNA诱导的基因沉默复合体（RNA-induced silencing complex，RISC）作用于靶点mRNA，通过对mRNA剪切或抑制其翻译过程而调控基因的表达。目前人们还不明确miRNA及其靶mRNA之间的作用机制。 ??????? 最近有研究指出，miRNA在细胞生长、发育、分化、死亡等生物过程中起着重要的作用，同时，miRNA参与了血细胞生成、胰岛素分泌、神经系统构成和人类癌细胞生长等不同的过程，因此，非常有必要开发有效的实验工具来测定miRNA。 ???????? 目前检测miRNA的方法主要有Northern印迹分析，微点阵（microarray）分析和实时定量PCR（quantitative Real-Time PCR）。下面将对这三种方法做简单的介绍及比较。 1、Northern印迹分析（Northern Analysis） ??????? Northern印迹是基于杂交检测RNA的常用方法，它是最早用于miRNA分析的几种方法之一。这种方法简单易行，大部分实验室都可以进行操作，不需要额外的资金投入与设备更新。 不足之处： 1）Northern分析的过程涉及大量人工操作，并且每次仅有一条miRNA探针与一个RNA印迹杂交，因此，它适用于不适用于大规模的筛选实验。尽管如此，在简单探究miRNA功能机理的实验中，Northern印迹分析还是能够满足研究需要的。 2）Northern印迹分析的动态范围只能达到两个数量级，这就引发了一个严重的问题，进行实验的细胞内的miRNA分子的数量要达到比较大的范围，例如，能够检测40,000个miRNA分子每细胞的印迹条件实际上却不能准确检测10个miRNA分子每细胞。另外，由于Northern印迹以杂交为原理，它通常不能有效区分具有细微序列差异的miRNA。例如，同一个家族中的miRNA let-7c与let-7a和let-7b之间仅有一个碱基的差异，导致Northern印迹分析无法清晰区分它们。此外，Northern印迹实验的重复性较弱。 3）Northern印迹耗时，耗量。进行一次miRNA检测需要3个工作日，不仅减慢了实验进程，也增加了杂交膜上信号扩散的风险。此外，Northern印迹大概需要5到10微克的总RNA量上样量才能成功检测出miRNA，增加了检测干细胞或人类初期肿瘤细胞这些稀少的样品的难度，甚至无法顺利开展实验。 2、微点阵（Microarray）分析 ??????? 微点阵分析也是基于杂交的原理来检测miRNA，它通过测定特定过程中miRNA的表达水平，来分析了解miRNA的表达调控机制以及由miRNA调控的基因的表达。微点阵采用高密度的荧光标记探针与RNA样本杂交，通过荧光扫描获得表达图谱，借助相应软件进行miRNA的表达分析。由于在设计探针时可以包含所有可用miRNA序列，因此微点阵可以作到高通量的miRNA分析。 不足之处： 1）微点阵仍然需要足够的RNA初始样本，大约为每个微点阵5微克。 2）由于微点阵以杂交为基础，因此同Northern印迹一样无法清楚的区分序列差异很小的miRNA。另外，微点阵也很难区分具有相同序列的前体miRNA和成熟的活性miRNA。 3、定量实时PCR（Quantitative Real-time PCR） ?????? 定量实时PCR技术通过扩增技术，是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。起始目标核酸的拷贝数越高，就越快观察到荧光强度的显著增加。定量实时PCR中TaqMan?? (Roche Molecular Systems Inc., Basel, Switzerland)特异性分析依赖于两个PCR引物和一个序列特异的TaqMan探针的联合作用。这些荧光标记的探针利用Taq DNA聚合酶的5’核酸酶的活性，极大的提高了实时PCR的检测，从而使得对PCR后期加工中探针的降解分析的评估成为可能。 ????????? 尽管定量实时PCR相比Northern分析和微点阵需要较少的样本，并且显著的提高了动态范围和敏感度，但是这种技术在检测miRNA时还是遇到了挑战。由于成熟miRNA长度较短，难以设计成熟miRNA的有效的